甜菜霜霉病研究初报

甜菜霜霉病菌以卵孢子在病种子和病残体上越冬,也可以卵孢子或菌丝在窖藏母根上越冬,翌年卵孢子萌发或母根中菌丝生长产生孢子囊作为初侵染源。该菌远距离传播主要靠带菌种子或母根。潮湿冷凉环境下易发生甜菜霜霉病,过量施用氮肥,栽培密度过大,造成田间郁蔽有利病害发生。应用７５％百菌清可湿性粉剂、５８％甲霜灵锰锌和４０％增效瑞毒霉粉剂,采用叶面喷雾或喷雾与拌种相结合对该病均有较好防效。     

苏北杨树新造林地溃疡病发生规律观察

杨树新造林地溃疡病的发生时间为冬末初春,一般在2月底或3月初,4~5月为发病高峰期,秋季较少有病斑出现。杨树新造林地溃疡病的发生与气候条件、育苗技术、造林技术等密切相关。在春旱、夏旱、暖冬等气候异常年份、育苗密度过大、施氮肥过多过晚、造林技术不规范等情况下,杨树新造林地溃疡病发生严重,造林成活率低。     

引起葡萄黄化类症状的病毒和类病毒RT-PCR检测

[目的]明确引起新疆葡萄黄化类症状的病毒及类病毒种类,分析其单病毒和复合感染情况,为葡萄病毒及类病毒的防治提供重要的理论依据和有效的检测技术.[方法]利用已报道的6对特异性引物(GRSPaV-RSP48/49、GFKV-L630/U279、GLRav2-V2dCPf2/V2CPr1、HSVd-f/r、GYSVd1-fl/r1和GYSVd2-f2/r2)分别对新疆不同地区黄化类症状的葡萄病样进行RT-PCR检测,并对各引物的扩增产物进行序列分析.[结果]3种病毒及3种类病毒(GRSPaV、GFkV、GLRaV-2、GYSVd2、GYSVd1和HSVd)在新疆葡萄中均有不同程度的感染,其感染率分别为36.1;、51.4;、48.6;、37.5;、37.5;、94.4;;72个病样中,2种以上病毒或类病毒复合感染率约为75;,6种病毒或类病毒复合感染率为10;以上.[结论]可侵染新疆葡萄引起黄化类症状的病毒和类病毒可达6种,且复合感染较为普遍.     

瓜类细菌性果斑病菌突变体文库的构建及群体感应信号分子突变株的筛选

利用三亲杂交的方法将带卡那抗性的Mini-Tn5转座子随机插入瓜类细菌性果斑病菌xjl12基因组DNA中,构建插入不同位点的突变体文库,通过信号分子高效检测菌株JZAI,筛选群体感应信号分子失活突变株.挑取2株野生株和筛选出的4株突变株,进行Southern杂交,结果表明,转座子Mini-Tn5以单拷贝随机诱变瓜类细菌性果斑病菌获得成功;对筛出的4株突变株进行了致病性和烟草过敏反应测试,发现突变株明显降低了致病性,且2株突变株(5-17,2-57)在烟草上无过敏反应.瓜类细菌性果斑病菌突变体文库的成功构建及筛选到不同突变位点的群体感应信号分子失活突变株,对从基因水平研究瓜类细菌性果斑病菌致病分子机理及群体感应相关基因奠定了基础.     

彩色马蹄莲细菌性软腐病菌的鉴定及其群体感应淬灭的研究

近几年南京种植的彩色马蹄莲软腐病发生严重,从不同品种的彩色马蹄莲不同部位病组织中分离到6个菌株,经形态特征与培养性状比较、生理生化测试、16S rDNA序列分析和致病性测定,鉴定为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovora subsp.carotovora,P.c.c).信号分子检测结果表明,分离菌株可产生并释放出N-酰基-高丝氨酸内酯(AHLs)类信号分子.利用PCR技术扩增土壤根癌农杆菌中的attM基因,其编码的AttM解酯酶可以显著降解AHLs,在离体条件下可有效地减弱该病原菌的致病性,这为有效控制彩色马蹄莲细菌性软腐病提供了一种新途径.     

苏北杨树新造林地溃疡病病原菌的鉴定

2001年以来,苏北地区每年春季杨树新造林发生大面积死亡,在死亡或濒临死亡的杨树枝干上,几乎都有溃疡病症状的病斑发生。本试验通过对杨树新造林地(I-72杨)溃疡病病组织的分离、纯化培养获得10余株菌株,经接种、发病后再分离,获得6株拟茎点霉菌株;进一步克隆并分析供试菌株核糖体DNA-ITS区域的序列,结果是分离菌株与GenBank中Phomopsis eucommiicola的ITS序列有同源性,相似性达到99%。因此将该拟茎点霉菌确定为Phomopsis eucommiicolaC.Q.Chang,Z.D.JiangP.K.Chi,。该病原菌侵染杨树引起杨树新造林木溃疡病是首次报道。     

瓜类细菌性果斑病菌hpaP基因的功能分析

瓜类细菌性果斑病(bacterial fruit blotch of watermelon,BFB)是近年来发生在西瓜、甜瓜等葫芦科(Cucurbitaceae)植物上的重要细菌病害,由西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli,Ac)引起.本研究以xjL12菌株为背景构建了转座子(Tn5)插入文库.通过注射接种哈密瓜(Cucumis melo var.saccharinus)子叶和烟草叶片进行突变体的筛选,得到l株致病性完全丧失并失去激发烟草(Nicotiana tabacum)过敏反应的突变体△xj48.对△xj48中转座子插入基因的克隆和测序表明,其突变基因为西瓜噬酸菌Ⅲ型分泌系统(T3SS)中的保守基因hpaP.利用基因重组技术构建了hpaP基因的突变体,发现hpaP突变后影响了xjL12菌株的游动性、生物膜的形成能力及hrcV基因的表达.hpaP基因的互补菌株部分恢复其致病力.本研究证实了果斑病菌中的hpaP基因与该细菌的致病力相关,在侵染瓜类作物的过程中起着不可缺失的作用.     

应用锁式探针结合斑点杂交技术检测甜瓜细菌性叶斑病

【目的】甜瓜细菌性叶斑病是危害甜瓜的重要种传细菌病害,是由丁香假单胞杆菌流泪病致病变种甜瓜菌株(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)引起的。论文旨在建立高效、快捷、操作简单的检测技术以防止此病原菌传播。【方法】以Gen Bank公布的甜瓜细菌性叶斑病菌的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因序列为靶标,设计甜瓜细菌性叶斑病菌特异性锁式探针,建立锁式探针与斑点杂交技术结合的检测体系。以保存的目的菌株为材料,提取DNA作为模板进行锁式探针连接反应、酶切反应和扩增反应,并将锁式探针连接反应、酶切反应和扩增反应的反应温度和反应时间分别进行优化。利用优化的锁式探针连接反应、酶切反应和扩增反应分别对健康的甜瓜种子、带有甜瓜细菌性叶斑病的甜瓜种子、无菌水及25株其他参试菌株进行检测,测定该体系的特异性。将甜瓜细菌性叶斑病菌的DNA按10倍梯度稀释,依次稀释为1 ng·μL~(-1)、100 pg·μL~(-1)、10 pg·μL~(-1)、1 pg·μL~(-1)、100 fg·μL~(-1)、10 fg·μL~(-1)和1 fg·μL~(-1)作为模板,利用优化的锁式探针连接反应、酶切反应和扩增反应,测定灵敏度。将探针与斑点杂交技术结合建立高通量检测体系,将上述反应过程中的扩增产物固定于尼龙膜上,将锁式探针上Zipcode序列的反向互补序列合成c Zipcode(检测探针),检测探针(c Zipcode)用地高辛标记后与产物进行杂交。锁式探针结合斑点杂交技术分别进行特异性检测和灵敏度测定。探针与斑点杂交技术结合建立的高通量检测体系进行人工模拟种子带菌检测,进一步验证该体系的可靠性。利用建立的高通量检测方法对205份市售疑似带病的甜瓜种子进行检测。【结果】锁式探针特异性测定结果表明,26株甜瓜细菌性叶斑病菌均能得到一条105 bp的特异性条带,而剩余25株参试菌株及无菌水均无扩增产物产生。灵敏度测定结果表明,当目的菌株的浓度稀释为1 pg·μL~(-1)时均能检测到一条105 bp的特异性条带,所以探针的检测灵敏度为1 pg·μL~(-1)。探针与斑点杂交技术结合建立的检测甜瓜细菌性叶斑病菌高通量体系能将甜瓜细菌性叶斑病与所有的参试菌种区分开,26株甜瓜细菌性叶斑病菌杂交后出现了显色反应,而25株参试菌株及无菌水均没有发生显色。锁式探针结合斑点杂交的灵敏度检测同样达到1 pg·μL~(-1)。将锁式探针结合斑点杂交进行人工模拟种子带菌检测,能将1粒带菌种子从1 000粒健康的种子检测出来,模拟种子带菌检测率都能达到0.1%(1/1 000)。从205份市售甜瓜种子中成功检测到7份市售种子带菌。将带菌种子分别加入一定量的无菌水浸泡4 h,提取悬液DNA,将悬液DNA进行PCR扩增后测序,NCBI比对后确定为甜瓜细菌性叶斑病菌。【结论】基于锁式探针结合斑点杂交技术的检测体系能够快速、准确地识别甜瓜细菌性叶斑病。     

转群体感应淬灭基因attM烟草抗青枯病的研究

自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)克隆获得attM基因。采用叶盘转化法,农杆菌介导转化烟草,经过卡那霉素抗性筛选获得抗性愈伤组织,对其分化产生的植物株系进行PCR、PCR-Southern和荧光定量PCR及GUS染色检测分析。结果表明:attM基因被成功插入烟草基因组DNA中。在转基因株系中均能够表达,相对表达量最大可达125.8,最小为31.0。以野生型烟草和转pBI121空载体的烟草为对照,分别进行了离体及活体检测试验,结果表明:转attM基因烟草植株对茄科雷尔氏菌引起的青枯病抗性显著。1×107～1×108CFU.mL-1的青枯菌接种离体叶片,野生型烟草和转pBI121空载体的烟草的中毒面积与接种面积比值为15～25,转基因植株的比值低于3;青枯菌3×106CFU.mL-1伤根接种盆栽烟草植株14d,野生株和转空载体烟草均青枯死亡,病情指数为100,转基因植株病情指数为31.25。     

产酶溶杆菌OH11菌株胞外酶调控相关基因ctp的克隆及功能的初步分析

利用mariner转座子对产酶溶杆菌Lysobacter enzymogenes OH11进行转座诱变,构建菌株OH11的突变体文库.筛选到1株4种胞外酶(蛋白酶、纤维素酶、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶)产生均减少的突变株D-11.通过亚克隆,鉴定转座子的插入位点,涉及1个羧基末端蛋白酶(carboxy-terminal protease)编码基因ctp.通过同源重组的方法对该基因进行敲除,对缺失突变体Δctp表型分析发现:(1)Δctp与野生型OH11在营养丰富型(2YT)与营养缺陷型(MMX)培养基中生长速率基本一致;(2)Δctp降低了蛋白酶、纤维素酶和β-1,3-葡聚糖酶的产生,但不影响几丁质酶的产生;(3)Δctp生物膜的产生量明显减少.研究还表明,突变体基本不改变其对油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum、水稻纹枯病菌Rhizoctonia solani和辣椒疫霉病菌Phytophthora capsici的拮抗能力.互补菌株均恢复了野生型的相关功能.