东北林蛙体表两种常驻细菌的分离鉴定

以自然状态下健康东北林蛙(Rana dybowskii)体表常驻菌群为研究对象,用无菌水漂洗掉东北林蛙体表暂住菌后,用无菌拭子收集蛙体表常驻菌并进行培养,之后对单菌落进行分离纯化。通过对菌落形态观察、生化反应管等生化方法测定及16S rDNA序列检测,两方法同时鉴定出东北林蛙体表常驻细菌2种:醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)和产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes),属于环境常见革兰氏阴性细菌。根据结果推测东北林蛙体表常驻细菌来源于环境,并对其生物体起到一定的保护作用。     

狐胆汁中结合型胆汁酸成分的 RP-HPLC 检测1）

以蓝狐（ Alopex lagopus）胆囊胆汁为实验材料,采用正交试验建立了测定狐胆汁中结合型胆汁酸成分的高效液相色谱分析法。结果表明,采用Hypersil BDS C18（4．6 mm×250 mm,5μm）为色谱柱,V（甲醇）∶V（30 mmol/L磷酸二氢钾）＝70∶30的溶液（pH＝3．8）为流动相进行等度洗脱,流速为1．0 mL/min,检测波长为205 nm,柱温为25℃。测得狐胆汁中含有牛磺胆酸和牛磺鹅去氧胆酸,它们的峰面积比分别为35．05％和9．23％,不含牛磺熊去氧胆酸。各组分在3．33～10 g/L范围内具有良好的线性关系。本方法具有简单快速、分离效果好、重复性好等优点,可以用来分析狐胆汁中结合型胆汁酸。     

东北林蛙皮肤及其腺体组织形态学观察

本文观察了东北林蛙皮肤及其腺体组织形态学结构,结果表明：东北林蛙体表各部位皮肤薄厚不一,头部背侧皮肤最厚（224.4±5.46μm）,后肢腹侧皮肤最薄（135.7±5.06μm）,但基本结构相同,由表皮和真皮组成。表皮薄,为复层扁平上皮;真皮疏松层有大量腺体分布,主要是粘液腺和颗粒腺。粘液腺广泛分布于全身皮肤,颗粒腺多见于背部皮肤,以躯干背侧褶处体积最大。色素细胞分布于真皮浅层,以背侧皮肤多见。     

嗜水气单胞菌胁迫下东北林蛙皮肤MyD88和TRAF6基因表达的动态变化

采用高通量测序获得东北林蛙(Rana dybowskii)MyD88和TRAF6mRNA序列设计引物,将蛙类易感微生物嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)经东北林蛙腹腔注射后,用荧光定量PCR技术分析蛙皮肤MyD88和TRAF6mRNA表达水平的变化,以期揭示东北林蛙在识别嗜水气单胞菌后,其机体TLR信号通路中相关分子的免疫效应。数据显示,处理后12h试验组皮肤MyD88和TRAF6mRNA的表达量与对照组相比有明显升高且达到峰值,分别为2.38倍和8.12倍,其中TRAF6mRNA表达水平尤为显著,在24h~48h仍处于较高水平,分别为对照组的4.32倍和2.54倍。结果表明,嗜水气单胞菌胁迫能促使东北林蛙机体TLR信号通路中的MyD88和TRAF6mRNA的表达量上调。本研究探讨了微生物侵袭时东北林蛙的TLR信号调控机制,为认识两栖类机体的先天免疫系统奠定了一定的理论基础。     

Toll样受体信号通路在两栖类中的研究进展

两栖类处于脊椎动物由水生向陆生进化的过渡阶段,进化地位重要。近年来因疾病的爆发、生境破碎化、环境污染、紫外辐射增加、人为过度捕捉和生物入侵等诸多因素引起的全球范围内两栖类种群数量锐减已引起人们的广泛关注。Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)家族是一类从线虫到哺乳动物普遍存在的高度保守的模式识别受体(PRRs),可以识别侵入机体病原体的病原相关分子模式(PAMPs),是两栖类先天性免疫防御系统的重要组成部分。本文结合近些年国内外对两栖类TLRs的研究对两栖类TLRs结构特征、进化特点、在两栖类发育早期的差异表达特征和两栖类TLRs信号通路中相关分子的表达研究进行概述。目前对于两栖类TLRs的研究发现两栖类TLRs兼具鱼类和哺乳类TLRs的特征,并在从鱼类到两栖类到哺乳类的进化过程中,TLRs家族部分成员如TLR2的配体识别功能可能发生了一定程度的特化;在两栖类早期发育阶段,获得性免疫不够完善,以TLRs为主的先天免疫防御系统在抵御病原体的侵袭方面发挥了重要作用;在特定病原菌和病毒的胁迫下,可能激活了TLRs下游不同的途径参与两栖类对病原体的免疫应答反应。     

黑龙江省中国林蛙(Rana chensinensis)群体遗传多样性及区域分化的初步研究(英文)

本文运用随机扩增多态DNA (RAPD)技术对黑龙江省8个地区野外采集的中国林蛙(Rana c hensinensis)个体进行群体遗传多样性及区域分化的初步研究。实验筛选出的10个RAPD引物 共扩增出78条DNA多态片段。用NJ（Neighbor-Joining）方法分析遗传距离并构建系统树。 结果表明，中国林蛙(R. chensinensis)在8个不同采样地区已经出现明显的区域分化，且不 同地区的中国林蛙之间存在地理距离和遗传距离不相吻合。根据地理、地质学资料初步推论 ，黑龙江省中国林蛙(R. chensinensis)的中心发源区很可能位于松花江和黑龙江两江下游 的丘陵地区。并主要依靠松花江水系从三江平原进入松嫩平原，在方正地区形成向西扩散过 程中的次中心发源区。     

东北林蛙皮肤抗菌肽dybowskin-1ST的表达、纯化及抑菌活性分析

  【目的】利用毕赤酵母菌真核表达系统重组表达东北林蛙皮肤抗菌肽dybowskin-1ST,分析评价dybowskin-1ST的抑菌活性。【方法】采用TRIzol法提取蛙皮总RNA,经RT-PCR扩增获得抗菌肽dybowskin-1ST基因,将目的基因克隆到毕赤酵母菌分泌型表达质粒pPIC9K中,得到重组质粒pPIC9K-1ST。经电转化将pPIC9K-1ST转入到毕赤酵母菌GS115中,获得高效表达dybowskin-1ST的重组菌株。以甲醇诱导重组菌株,上清液经SDS-PAGE检测表明有目的蛋白dybowskin-1ST分泌表达。目的蛋白经Ni-agarose色谱柱分离纯化后,对大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯氏杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肠炎沙门氏菌和蜡状芽孢杆菌进行抑菌活性分析。【结果】成功构建了东北林蛙皮肤抗菌肽dybowskin-1ST的毕赤酵母真核表达系统,且dybowskin-1ST对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有良好的抑菌效果。【结论】东北林蛙皮肤抗菌肽dybowskin-1ST具有良好的广谱抗菌活性和潜在的研发价值。     

低温胁迫下黑龙江林蛙肝脏酶活性变化

初步分析了低温胁迫下黑龙江林蛙肝脏超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)、6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)及酯酶(EST)酶活性的变化.结果表明:1℃组的黑龙江林蛙肝脏SOD、LDH-1及EST的酶活性显著高于14℃组(P＜0.05),而2组的LDH、G6PDH及EST总酶比活力无显著性差异.为适应低温环境,黑龙江林蛙肝脏某些酶活性显著增加,维持了机体代谢的稳定.     

东北林蛙皮肤活性肽的反相高效液相色谱纯化体系建立

为建立东北林蛙皮肤抗菌肽反相高效液相纯化体系,将东北林蛙(Rana dybowskii)皮肤分泌物冻干粉用0.1%TFA水溶液溶解,并对分析样品进行全波长扫描,确定检测波长,通过SunfireTM C18(5 μm,4.6 mm×150 mm)色谱分析柱对分离条件进行了优化.结果表明:分泌物在216 nm和280 nm处均有明显的吸收峰;乙腈能使样品较早被洗脱,而甲醇则能延迟样品的洗脱;流速与样品保留时间、分离度成反相关.经试验证实,最佳液相色谱检测条件为:检测波长216 nm和280 nm;流动相为V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(水/TFA)=9∶1∶90;流速0.5 mL/min;进样量20 μL.     

小麦淀粉GBSSII基因的克隆、反义和RNAi载体的构建

采用RT-PCR方法从小麦品种豫教2号籽粒中克隆出颗粒型淀粉合成酶II基因(Granule bound starch syn-thase,GBSSII)部分cDNA片段(1 069 bp)(GenBank登录号:EF221764),同源性比较结果显示,它与GenBank上已报道的GBSSII基因有高度的同源性。以pWM101质粒为基础,构建了由35 S启动子调控的GBSSII基因的反义表达载体pWM101GBSSIIA;另外,还以pFGC5941质粒为基础,构建了GBSSII基因的RNAi载体pFGC5941GBSSIIsa,这些载体的构建为研究GBSSII基因的功能打下了很好的基础。