胰蛋白酶抑制剂SKTI3基因的克隆及其植物表达载体的构建

以大豆基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)技术克隆了大豆胰蛋白酶抑制剂基因SKTI3的全长DNA片段,并将其构建到pMD18-T vector上。核苷酸序列测定结果表明:该基因片段全长654 bp,与已发表的SKTI3基因序列同源性达99%。将目的基因片段插入到pB I121 35S启动子下,构建重组质粒pB ISKTI3,采用冻融法将该重组质粒转入农杆菌EHA105中,获得了植物表达载体。     

2种作图法对大豆蛋白含量性状QTL定位的比较研究

【目的】比较复合区间作图法(CIM)和完备区间作图法(ICIM)对大豆高蛋白含量性状QTL的定位效果,总结2种方法进行QTL作图的优缺点,为QTL作图方法的选择及分子标记辅助选择培育高蛋白含量大豆品种研究提供参考。【方法】以高油大豆品种吉农18和高蛋白大豆品种吉育47杂交后获得的F2分离群体为材料,结合2年的分子数据和表型数据,采用CIM和ICIM法对大豆蛋白含量性状进行QTL定位。【结果】利用CIM和ICIM-ADD,在连锁群12(B2+C1)和17(M)上共检测到了5个高蛋白QTL,其中ICIM-ADD检测到的QTL略多于CIM;由CIM在F2∶3家系和ICIM-ADD在F2代、F2∶3家系的检测结果可以看出,2种作图法在satt285～satt636标记区间内均检测到显著LOD,且QTL距第一个标记(satt285)的遗传距离≤5.0cM,可认为此3个QTL为同一QTL,其贡献率分别为10.87%,17.09%和17.34%,说明该QTL的稳定性较好,可在进一步的高蛋白分子辅助育种中加以利用。【结论】2种作图法各有其优缺点,在实际应用中应根据分析对象综合运用、合理选择作图方法,以最大限度地提高QTL作图的精度和效率。对研究中所定位的SSR标记,特别是稳定标记可以在今后的大豆高蛋白分子标记辅助选择育种中加以利用。     

利用RNA干扰技术提高大豆脂肪含量

利用冻融法将大豆11S球蛋白GY1基因RNA干扰表达载体转入农杆菌EH105中,以大豆"吉农28"为受体,通过农杆菌介导的大豆子叶节转化法导入大豆,获得T1代转基因苗12株,并对得到的转基因植株进行分子生物学鉴定。PCR和Southern杂交检测表明,RNAi植物表达载体p3301-Gy1已成功插入到转基因大豆植株的基因组DNA中;RT-PCR和SDS-PAGE检测结果表明RNA干扰在转录后水平发挥了作用,11S球蛋白表达含量降低;利用BUCHI N-500型近红外谷物分析仪对转化的大豆蛋白质和脂肪含量进行检测,结果转化植株的籽粒蛋白质含量(36.07%)平均降低1.43个百分点,脂肪含量(21.28%)平均提高0.76个百分点。因此,利用RNA干扰技术提高大豆脂肪含量是可行的。     

大豆杂交种及其亲本籽粒基因差异表达与杂种优势关系

采用4×5 NC II设计,以大豆鼓粒期未成熟籽粒为材料,应用mRNA差异显示技术,分析杂交种及亲本之间基因差异表达模式,并与杂种优势进行相关分析,以期从基因差异表达角度来揭示大豆杂种优势产生的机理。结果表明,杂交种和亲本之间存在明显的基因差异表达,差异表达模式可分为单亲表达一致一型(110型)、单亲表达一致二型(011型)、双亲共沉默型(101型)、单亲表达沉默一型(100型)、单亲表达沉默二型(001型)和杂种特异表达类型(010型)6种。差异表达模式与杂种表现的相关分析中,有11个相关系数达到显著或极显著水平。差异表达模式与中亲优势的相关分析中,株高与110型,分枝数、单株粒数、单株粒重与001型呈显著正相关。差异表达模式与超亲优势相关分析中,株高、节数与110型呈极显著负相关;茎粗与100型呈显著负相关;株高、虫食粒率和011型呈极显著正相关;蛋白质和110型,株高、节数与101型,百粒重与100型呈显著正相关。说明大豆鼓粒期基因差异表达与杂种优势形成有一定的相关性。     

基因枪法转移猪传染性胃肠炎病毒纤突蛋白基因玉米植株

以玉米自交系"丹598"、"H99"和"丹988"的胚性愈伤组织为材料,利用基因枪法将猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因的植物表达载体pBI121-S导入玉米自交系中,并对基因枪法转化的条件进行了研究,对转化的愈伤组织进行分化诱导出苗后进行PCR和RT-PCR检测。PCR结果表明,外源目的基因已转入到玉米基因组中;RT-PCR试验证明,目的基因能在转基因玉米植株中获得转录。     

分子标记技术在大豆遗传育种中的应用

大豆是世界上重要的经济与粮食作物,大豆研究一直受到人们的广泛关注,但与玉米、水稻等作物相比,其研究进展十分缓慢。20世纪80年代末,DNA分子标记技术的出现,大大提高了遗传育种效率。本文从大豆遗传图谱的构建、遗传多样性研究、数量性状基因分析、分子标记辅助育种等四个方面概述了分子标记技术在大豆遗传育种中的应用情况。     

聚糖内切酶EGⅢ的克隆及其在酵母中的表达（摘要）

[目的]构建可降解纤维类固体废弃物的工程菌。[方法]采用RT-PCR方法克隆了绿色木霉（Trichoderma viride）AS313711的葡聚糖内切酶Ⅲ（EGⅢ）的cDNA,测序后构建到酵母表达载体pESP-2上,并通过电击法将其转到酵母感受态细胞中去,得到酵母表达转化子。通过DNS法测定该转化子在不同温度、不同pH值下酶活力的大小。[结果]EGⅢ的cDNA开放阅读框长度为1 257 bp,编码418个氨基酸,推测蛋白质分子量为44.1×10~3。在pH值为4.9、温度在60℃条件下,EGⅢ酶活力最高,相对酶活为100%。[结论]获得了高表达效率的EGⅢ-T-pESP-2酵母表达载体,其表达活性要比天然的酶高出3～5倍,只要调节好温度、pH值的关系,可提高纤维素葡聚糖内切酶的下游转化纤维素效率,在大规模生产中生产出大量的葡萄糖。     

大豆BBi基因ihpRNA种子特异性表达载体的构建

【目的】构建具有大豆蛋白酶抑制剂BBi基因反向重复结构的ihpRNA种子特异性表达载体,并将其转入根癌农杆菌中,为大豆品质改良奠定基础。【方法】采用PCR技术克隆大豆蛋白酶抑制剂BBi基因的正义和反义片段、大豆种子特异性启动子7αP和作为内含子的GFP基因片段,分别连入克隆载体pMD18-T Vector中。然后根据植物中ihpRNA原理,以植物表达载体pCAMBIA1301为基础,将组成RNAi载体的4个目的片段分别连入其中,然后利用冻融法转化根癌农杆菌,并进行PCR鉴定。【结果】PCR扩增得到组成RNAi载体的4个目的片段,分别构建成重组克隆载体和ihpRNA种子特异性表达载体p7αP-GFP-BBiS,并转化得到含有p7αP-GFP-BBiS的农杆菌EHA101和EHA105。【结论】成功构建了具有BBi基因反向重复结构的ihpRNA种子特异性表达载体p7αP-GFP-BBiS,BBi基因的ihpRNA表达框架成功转入到农杆菌中。     

应用RNA干扰技术创造低脂肪氧化酶活性大豆新种质

 【目的】通过RNA干扰技术抑制大豆籽粒中脂肪氧化酶基因表达,改良大豆品质,创造优良大豆新种质,探索大豆品质育种新途径。【方法】采用RT-PCR技术克隆大豆籽粒脂肪氧化酶基因（Lx1、Lx2、Lx3）核心保守序列357 bp片段,通过重组PCR构建大豆脂肪氧化酶基因RNA干扰表达载体,利用花粉管通道法转化大豆品种吉农18。【结果】获得了12个转基因株系,其中10个株系发生明显变化,SDS-PAGE电泳和脂肪氧化酶活性测定表明转基因植株籽粒中脂肪氧化酶活性明显降低,平均减低64.2%;经近红外谷物分析仪测定,转基因植株脂肪含量平均提高0.8%～1.5%,总蛋白含量降低1.2%～3.0%;RT-PCR结果表明转基因株系中脂肪氧化酶mRNA积累受到明显抑制。转基因植株2代及3代检测结果表明,转基因植株脂肪氧化酶活性均明显降低,脂肪含量均有所提高。【结论】应用RNA干扰技术可有效的抑制大豆籽粒中脂肪氧化酶基因表达,降低脂肪氧化酶活性,提高大豆油份含量,改良大豆品质,创造优良大豆种质。     

吉林省主推中晚熟期玉米品种遗传多样性分析（摘要）

[目的]应用SSR分子标记研究吉林省主推中晚熟期玉米品种的遗传多样性。[方法]通过10对引物对供试材料进行扩增,并用聚丙烯凝胶电泳进行检测。[结果]10对SSR引物在供试材料中共检测出110个等位基因变异,每对SSR引物检测出的等位基因数为4～17个,平均每个位点11个,每个SSR位点的PIC变化范围在0.63～0.93之间,平均0.842。43个玉米杂交种之间的遗传相似系数变化范围为0.664～0.918,平均为0.774,其中样本间遗传相似系数在0.85以上的共有30个。结合聚类分析和各品种的谱系来源,结果表明43份吉林省主推中晚熟期玉米品种的遗传相似性相对较大。[结论]吉林省中晚熟期种质资源相对狭窄,有待于进一步引种创新。