桑花叶卷叶病相关病毒外壳蛋白抗体的制备及利用

对桑花叶卷叶病相关病毒外壳蛋白抗原性较好的核心结构域进行克隆和序列多样性分析,结果表明50个克隆中有19个克隆株,CP16为优势株。构建重组表达载体pET-28a-SUMO-CP16,成功在大肠杆菌Rosetta中诱导表达该蛋白,利用亲和层析纯化重组蛋白并制备多克隆抗体。经Western杂交和ID-ELISA检测合格的抗体偶联Tosylactivated磁珠,用于桑花叶卷叶病相关病毒的纯化。经qPCR技术检测显示,纯化后的病毒样本中的背景RNA得到极大的减少,获得了高纯度的病毒样品。     

桑花叶萎缩类病毒滚环扩增检测技术体系的建立

为建立一种快速、灵敏、简单的检测类病毒的方法,以桑花叶萎缩类病毒为研究对象,根据其基因组设计了1条特异性连接环化的寡核苷酸链探针和2条PCR扩增检测引物,对收集到的6份桑花叶型萎缩类病毒样品进行了滚环扩增。结果所有样品的RCA扩增产物的核酸电泳,条带呈阶梯状分布,但大部分聚集于上样孔附近,与理论分析相符,表明该方法适用于桑花叶萎缩类病毒的快速检测。进一步利用人工合成的模拟DNA分子测试该检测方法的灵敏度,研究显示,利用RCA技术可以成功检测到10~3拷贝的模式DNA分子。     

寄主和非寄主植物中MMDVd正负链比例的研究

引物特异反转录结合实时荧光定量PCR技术对MMDVd在寄主和非寄主植物体内正负链的积累差异进行了研究。根据MMDVd基因组序列,设计了3对反向互补的反转录引物,对桑树和拟南芥中的MMDVd的正负链进行引物特异的反转录,荧光定量PCR技术对纯化后的c DNA进行定量分析。分析表明,桑树中,3组反转录引物的结果都是负链高于正链,为2~9倍,而拟南芥中,正负链的比例不定,显示了较高的随机性。本研究可为进一步的类病毒的侵染机制及其寄主域的研究提供参考。     

家蚕糖转运蛋白BmST5基因的克隆与转录活性检测

根据GenBank已登陆的糖转运蛋白序列与家蚕基因组框架图和EST序列,获得家蚕同源糖转运蛋白基因BmST5。基因编码区长1 527 bp,编码508个氨基酸,预测蛋白分子质量为55.67 kD。序列分析结果显示,该基因有典型的Sugar_tr结构域和12个疏水的跨膜结构域,与体虱等同源蛋白的一致性在50%以上。RT-PCR结果表明,该基因仅在家蚕的马氏管、生殖腺和头中有表达,在中肠、丝腺、血液、体壁和脂肪体中不表达。     

BmNPV DNA解旋酶基因酵母双杂交诱饵载体的构建

为了筛选家蚕对BmNPV DNA解旋酶的受体基因,根据GenBank公布的BmNPV (T3株)的序列,设计引物对其DNA解旋酶基因的核心结构域进行PCR扩增,成功克隆该基因并利用双酶切亚克隆至酵母双杂交诱饵载体PGBKT7.实验证明重组诱饵载体不能自激活,可以作为诱饵进行蛋白结合试验.     

桑树DNA连接酶Ⅰ基因MuLigI的获取和序列分析

为进一步研究DNA连接酶Ⅰ在类病毒复制中的作用,以感染桑花叶萎缩类病毒的桑树叶片为材料,通过在同源基因保守区设计简并引物进行PCR扩增和cDNA末端扩增,获取桑树DNA 连接酶Ⅰ基因。结果获得桑树DNA连接酶Ⅰ基因MuLigI长2730 bp的mRNA序列,基因编码区长2367 bp,编码788个氨基酸,含典型的DBD结构域(173~351 aa)和CD催化结构域(405~771 aa),N端含有核定位(NLS)和线粒体定位信号(MLS)。研究所得桑树DNA连接酶Ⅰ基因具有保守的结构域和活性位点,可能和番茄的DNA连接酶Ⅰ基因一样,参与了桑花叶萎缩类病毒的复制过程。     

家蚕moricin基因家族的诱导表达

[目的]节究不同外源微生物对家蚕moricin抗菌肽的诱导表达。[方法]应用3种外源微生物BmNPV、JM109以及农杆菌LBA4404对家蚕进行诱导,RT—PCR检测moricin基因被诱导后在家蚕脂肪体的表达。[结果]结果表明,moricinB1和moricinB3基因有高的诱导表达水平,moricinA1和moricinB2基因表达差异不明显。[结论]MoricinB1和MoricinB3蛋白可能对大肠杆菌具有抗菌     

家蚕含染色质域基因Bm-msl3的克隆和转录活性检测

染色质域是从酵母到哺乳动物的真核生物中普遍存在的一个保守的基因元件,参与染色质重组和基因表达调节。根据NCB I登录的果蝇和人的MSL3序列以及家蚕的基因组与EST数据库克隆了家蚕含染色质域的基因Bm-msl3(GenBank登陆号:DQ887343)。该基因mRNA序列全长2 356 bp,在2 168 bp处有1个AAATATTA加尾信号,基因的编码区长1 665 bp,包括13个外显子。推定的蛋白质编码554个氨基酸,序列的N端含有一个保守染色质域。RT-PCR检测表明该基因在所调查的家蚕发育时期和组织中均有表达。     

家蚕黄酮合酶I基因BmFNS I的克隆与干涉载体的构建

黄酮类化合物广泛存在于动植物中,具有多种生理活性,黄酮合酶I基因可以催化多种黄酮类化合物的生物合成.根据NCBI已登录的其他物种黄酮合酶I基因的氨基酸序列,与家蚕基因组和EST数据库进行电子克隆获得家蚕的同源基因BmFNS I.克隆测序结果表明该基因长1 451 bp,7个外显子.根据基因序列推测其编码蛋白由345个氨基酸构成,179～295间氨基酸为一2-氧戊二酸和Fe(II)依赖性的加氧酶家族成员的结构域.RT-PCR检测该基因在本试验所调查的家蚕中肠有高表达.最后将该基因片段亚克隆至具有2个反向T7启动子可以用于体外诱导合成dsRNA的L4440载体.     

3种微生物诱导的家蚕attacin基因异常表达形式的研究(英文)

[Objective] The aim of this research was to study the expression of silkworm attacin gene induced by some different microorganisms.[Method] Three kinds of microorganism,BmNPV,JM109 and Agrobacterium LBA4404,were ingested to silkworm and the expression profile of attacin gene in hemocyte and fat body was detected by semi-quantitative PCR.And subsequently,the PCR products were cloned and sequenced for further analysis.[Result] A specific band,about 800 bp,appeared in fat body of all induced silkworms.As indicated by the results of cloning and sequencing(GenBank accession number:FJ373019),the band was produced because the 2 introns existing in normal expression form were not spliced.Furthermore,when the extended expression sequence was translated into amino acids,the translation stopped earlier by the stop codon TGA at the 5’ end of the first intron of the original sequence,leading the loss of attacin C terminus.[Conclusion] There were two splicesomes of attacin gene,which had reference value to study the role of the attacin gene in silkworm immunity.