气相色谱法检测牛乳中共轭亚油酸的研究

共轭亚油酸（CLA）主要存在于反刍动物乳制品中,本试验建立了气相色谱法检测CLA的方法,采集牛乳提取脂肪检测脂肪酸中CLA的含量,发现在试验条件下c9,t11-CLA占到总脂肪酸含量的1．25‰是CLA异构体的主要形式。     

复方中药对肉鸡免疫功能和抗氧化功能的影响研究

笔者自拟一剂中药（炙黄芪200 g、当归160 g、何首乌120 g、淫羊藿120 g、扁豆100 g、黄柏20 g、穿心莲20 g、附子160 g、炙甘草100 g）,以艾维茵肉鸡为试验动物,研究其对禽免疫功能和抗氧化功能的影响。试验结果表明,试验各组与对照组比较,免疫器官指数、淋巴细胞转化率、血清中抗体水平3项指标均有显著差异（P＜0.05）;血液中超氧化物歧化酶(SOD)的活性和总抗氧化能力2项指标也有显著差异（P＜0.05）。     

纤维素酶对草鱼生长性能和饲料消化率及体成分的影响

选用120尾当年鱼种(初始体重47.8g左右)，随机分为四组（即对照组、I组、II组、III组，每组30尾）在水族箱中进行饲养。对照组饲喂基础饲料，I组饲喂基础日粮+0.05%纤维素酶，II组饲喂基础饲料+0.1%纤维素酶，III组饲喂基础日粮+0.2%纤维素酶，每天投喂4次,试验期共饲养49d，探讨外源性纤维素酶对草鱼生长性能、饲料消化率和体成分的影响。结果表明:饲料中添加纤维素酶，草鱼增重率提高，饵料系数降低；干物质、粗蛋白、粗脂肪和粗纤维消化率都提高；体成分没有显著变化。     

沉默SCAP基因对奶牛乳腺上皮细胞脂滴的影响

旨在探究沉默固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(SREBP cleavage-activating protein,SCAP)对奶牛乳腺上皮细胞脂滴的影响,本研究构建了SCAP短发夹RNA慢病毒载体,包装感染奶牛乳腺上皮细胞,通过在培养基中添加嘌呤霉素筛选获得SCAP基因沉默稳转细胞株,采用Real-time PCR和Western blot观察基因沉默细胞株中SCAP基因和蛋白的表达,尼罗河红和油红O染色脂滴检测SCAP基因沉默及SCAP质粒瞬时转染对细胞脂滴形成的影响。结果表明,本研究成功构建了奶牛SCAP基因沉默慢病毒重组载体,感染细胞后经过5 mg·L^-1嘌呤霉素筛选得到SCAP基因沉默稳转细胞株。基因检测发现,各个沉默细胞株的SCAP基因表达显著降低(P<0.05或P<0.01)。与对照组相比,RNAi-SCAP3细胞中的SCAP蛋白表达降低为对照组的0.49倍(P<0.05),脂代谢基因SCD和FAS表达也显著下降(P<0.05)。脂滴染色发现,RNAi-SCAP3沉默细胞株的脂滴含量显著低于对照组细胞(P<0.01),脂滴直径≤2.0μm的小脂滴个数增多,而直径≥2.5μm的大脂滴个数减少;将SCAP真核表达载体瞬时转染RNAi-SCAP3细胞株后发现,SCAP基因的过表达显著减少了细胞中小脂滴比例而增加了大脂滴比例(P<0.05)。本研究成功构建了SCAP基因沉默稳转细胞株,发现SCAP的表达影响了细胞脂滴直径的大小。     

PRRSV VR2332弱毒株经滴鼻、注射途径接种仔猪的病毒血症和抗体产生的差异分析

为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)VR2332弱毒株经滴鼻和注射两种途径接种仔猪的病毒血症、抗PRRSV抗体以及抗PRRSV中和抗体的差异,选取20日龄健康仔猪9头,随机分3组,即滴鼻组、注射组和对照组。在感染后第0、3、7、11、15、19、23、27、31、35、39、43天前腔静脉采血,于第43天采血后摘取猪的脾、颌下淋巴结、腹股沟淋巴结和肠系膜淋巴结,并无菌收集猪肺泡巨噬细胞(PAM),通过实时荧光定量PCR方法检测病毒载量。用ELISA方法检测抗PRRSV抗体效价,用基于PAM的中和试验检测抗PRRSV中和抗体效价。结果显示:仔猪感染PRRSV后,①滴鼻组第3天只在2头猪血清中检测到PRRSV,第15-19天病毒血症达到高峰,病毒拷贝数均大于104拷贝·μL-1,第27天后病毒血症消失;注射组第3天从3头仔猪血清中均检测到病毒,在第15-23天病毒血症达到高峰,其中第19天病毒拷贝数大于105拷贝·μL-1,病毒血症从第31天后开始消失。②从几种淋巴结和PAM中均检测到PRRSV,且注射组的PRRSV拷贝数稍高于滴鼻组。③均在第27天从血清中检测到抗PRRSV抗体,随后抗体水平一直处于逐渐上升趋势,且第35-43天,注射组的抗PRRSV抗体水平高于滴鼻组。④滴鼻组在第35天之前抗PRRSV中和抗体效价都小于1∶2,第43天抗PRRSV中和抗体效价为1∶2;注射组在第3、11和19天的抗PRRSV中和抗体效价均小于1∶2,第27、35、43天的中和抗体效价分别为1∶4、1∶8、1∶4。试验结果表明,注射组的病毒拷贝数一直为滴鼻组的10～100倍,且病毒血症持续时间更长;注射组血清中抗PRRSV抗体产生的时间比滴鼻组早,并且抗体水平比滴鼻组高;滴鼻组抗PRRSV中和抗体水平很低,注射组产生的抗PRRSV中和抗体比滴鼻组早且抗体水平高。综上所述,VR2332弱毒株经注射免疫比滴鼻免疫能刺激猪产生更高水平的中和抗体,但同时也会引发更高水平的病毒血症。     

奶牛硬脂酰辅酶A去饱和酶基因(SCD)启动子的克隆及活性分析

硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)是脂肪酸合成过程中的一个主要限速酶,为了研究奶牛脂肪合成的基因调控机制,本研究首先从奶牛组织中克隆得到4个不同长度的SCD基因启动子片段(分别为212、380、416和760bp),采用生物信息学的方法分析了启动子上不同的转录因子结合位点,将克隆片段与pGL3-basic荧光素酶报告基因载体进行KpnⅠ和XhoⅠ双酶切,连接形成重组启动子载体pGL3-SCD1、pGL3-SCD2、pGL3-SCD3和pGL3-SCD4。将载体纯化后,瞬时转染到HepG2细胞,对细胞施加胰岛素(10IU/mL)和亚油酸(120μm)处理,通过双荧光素酶报告基因检测启动子荧光素酶相对活性,结果发现,在SCD启动子序列上存在Sterol-regulated element(SRE)转录因子的结合位点,随着SCD启动子片段长度的延长,启动子活性也显著提高,pGL3-SCD4具有最高的启动子活性。与对照组相比,pGL3-SCD1~4启动子的活性在胰岛素刺激下都显著增强(P<0.05),其中pGL3-SCD4的启动子的相对活性最高,达到了46.93。在亚油酸刺激下,pGL3-SCD1~3的启动子活性没有显著变化,而pGL3-SCD4的活性显著减弱(P<0.05),研究表明pGL3-SCD4启动子上增加的片段(-398~-742)可能对于SCD基因的表达调控具有重要作用。     

利用牛乳汁体细胞研究乳腺免疫相关因子的表达

利用乳汁体细胞分子生物学技术平台,以奶牛初乳和末乳为研究对象,看家基因GAPDH为内参,对乳汁中IL-8、CCL5、CXCL14、κ-CN和α-LA进行半定量RT-PCR分析。结果显示,在209、202、376、151、233bp位置分别出现5种基因预期大小的特异性扩增条带。乳中IL-8、CCL5、CXCL14、κ-CN和α-LA mRNA转录水平的相对定量结果表明,与初乳相比,末乳中IL-8和α-LA mRNA的转录水平显著降低（P〈0.05）,CCL5、CXCL14和κ-CN mR-NA的转录水平分别下降21%、40%和37%,差异不显著（P〉0.05）。结果提示,末乳期奶牛乳腺免疫功能下降,应加强此阶段的管理,降低乳房炎的发生。     

Galectin-13基因在仔猪断乳前、后胃肠道组织表达差异性分析

从仔猪的十二指肠组织中克隆Galectin-13基因,研究Galectin-13在仔猪不同组织中的分布情况,并采用实时荧光定量PCR检测Galectin-13基因在断乳前、后仔猪胃肠道组织中的表达差异情况。结果表明:成功克隆出了猪Galectin-13基因序列,并被GenBank收录(Accession.NM_001142841)。与断乳前相比,断乳后Galectin-13基因的mR-NA在十二指肠、回肠组织中的表达量显著上调(P0.05),而在胃、空肠、盲肠和结肠中的表达量与对照组相比差异不显著(P0.05)。     

应用地高辛标记探针原位杂交方法检测仔猪小肠FcRn的表达

摘 要：【研究目的】旨在建立检测仔猪小肠FcRn表达的地高辛标记探针原位杂交的方法,研究FcRn在仔猪小肠各段的表达分布。【方法】根据GenBank公布的猪FcRn 重链（α链）mRNA基因保守序列设计并合成带地高辛标记的原位杂交试验用cDNA探针。经仔猪小肠冰冻组织切片最佳厚度选择,以及H2O2溶液祛除小肠组织中内源性辣根过氧化物酶作用对杂交结果的影响,选择合适的固定剂、细胞膜蛋白消化剂、杂交液和确定杂交反应的温度、时间以及杂交后处理等一系列试验条件优化,建立了检测仔猪小肠FcRn mRNA的原位杂交方法。【结果】①仔猪小肠冰冻组织切片最佳厚度为14 μm;②仔猪小肠内存在内源性辣根过氧化物酶,3％的H2O2溶液祛除该酶的效果良好,但在本研究中内源性辣根过氧化物酶的存在试验结果并无明显影响,无需祛除;③在仔猪十二指肠、空肠和回肠组织的小肠腺和粘膜下层等部位存在棕黄色阳性颗粒,均检测到清晰的杂交信号。【结论】应用地高辛标记探针进行仔猪小肠FcRn mRNA的原位杂交方法检测效果良好;FcRn mRNA在仔猪十二指肠、空肠和回肠组织等营养物质吸收部位均有表达,提示FcRn在这些部位的存在与肠道IgG转运的相关性。     

仔猪组织基因表达中实时定量PCR内参基因的选择

实时定量PCR研究中需要选择表达稳定性高的内参基因才能准确地校正目标基因的表达量。以仔猪不同组织为研究对象,应用实时荧光定量PCR技术,检测了beta-肌动蛋白（ACTB）、beta-2-微球蛋白（B2M）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）、羟甲基胆素合成酶（HMBS）、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶1（HPRT1）、核糖体蛋白L4（RPL4）、琥珀酸脱氢酶（亚基A）（SDHA）、TATA盒结合蛋白1（TBP1）和酪氨酸3-单氧化酶/色氨酸5-单氧化酶激活蛋白zeta多肽（YWHAZ）共9个看家基因mRNA水平的表达情况。经geNorm程序统计学分析处理,结果表明,9个看家基因的表达稳定性为HMBS和HPRT1〉RPL4〉TBP1〉B2M〉YWHAZ〉SDHA〉GAPDH〉ACTB,确定了HMBS基因在仔猪不同组织中用于校正目标基因的表达量为最佳选择,而RPL4基因则可以作为高转录本的内参基因。