新疆多浪羊淋巴细胞分离和培养

采集多浪羊的外周静脉血液,用人淋巴细胞分离液进行分离,收集分离得到淋巴细胞,同时经过纯化后通过镜检观察细胞形态。将纯化后的淋巴细胞在RPM I1640中置37℃,5%CO2培养箱4,6,8和12 h进行培养并观察淋巴细胞,其存活率分别为93.1%、92.4%、91.5%和90.6%。本试验成功地建立了多浪羊外周血淋巴细胞的分离技术和体外短期培养体系。     

鲤鱼白细胞介素-8全长cDNA的克隆、鉴定及其差异表达分析

用DD-RTPCR的方法获得差异显示片段A26,经地高辛标记作为探针对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库核酸杂交筛选,从0.8×104个重组噬菌体中,经过2轮筛选获得阳性克隆。序列分析表明该克隆含有1个大小为294bp编码98个氨基酸的完整开放阅读框,氨基酸序列含有Chemokine-CXC功能结构域,前体中含有22个氨基酸组成的引导肽,氨基酸序列比对显示成熟白细胞介素-8(IL-8)多肽中第12、13和14构成CXC基序,但之前无ELR基序。系统发生分析其与荷兰鲤鱼亲缘关系最近,氨基酸序列的同源性达89%。分离培养鲤鱼外周血白细胞,在不同条件下经LPS、PHA和ConA刺激后,提取总RNA,根据鲤鱼IL-8全长cDNA序列和β-ac-tin序列设计引物,利用半定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法对鲤鱼外周血白细胞IL-8进行差异表达分析,结果显示,经有丝分裂原刺激后前期(4h)白细胞中IL-8的表达量明显增大,但随着时间推移(12、24h)并不一直比同期正常白细胞表达量大,表达量趋势成峰形图。     

2个旋毛虫新生幼虫期特异性相似cDNA的克隆及序列分析

利用旋毛虫新生幼虫期特异性 c DNA探针 ,从新生幼虫 c DNA文库中筛选出 2个相似的旋毛虫新生幼虫期特异性 c DNA克隆 ,分别命名为 N5和 N10 ,N5长度为 12 5 0 bp,N10长度为 12 33bp。 NCBI Blast检索表明 ,2个c DNA全长序列均为旋毛虫新基因序列。DNASIS分析表明 ,N5与 N10的开放阅读框架分别为 10 14、10 17bp,编码338、339个氨基酸 ,推导的成熟蛋白氨基酸序列均为 32 1个氨基酸残基 ,相对分子质量推导值分别为 35 30 0和 354 0 0。 2个氨基酸序列中 N端均包含有一信号肽序列 ,可能为分泌性蛋白。NCBI Blast及 Inter Proscan检索表明 ,以上2个氨基酸序列均含有 型核酸酶的功能结构域 ,均编码 型核酸酶 (DNase ) ,且与已报道的旋毛虫包囊形成相关蛋白 P4 3(经鉴定也为 DNase )同源性最高。目前已有的试验结果证实 ,P4 3并未直接参与包囊的形成 ,而是一种与P4 3蛋白同源性非常高的蛋白参与了旋毛虫包囊的形成。由于 N5与 N10为旋毛虫新生幼虫期特异性表达基因 ,也就是在旋毛虫包囊形成的时期表达 ,而且与 P4 3具有较高的同源性 ,并均编码 DNase 蛋白 ,因此 N5、N10具有参与旋毛虫包囊形成的潜在可能     

喀什地区绵羊无浆体感染情况调查

为了解喀什地区绵羊无浆体的感染情况,采用吉姆萨染色法对喀什地区12个市(县)共278份绵羊血液样品进行显微镜检查。结果表明:无浆体总感染率为45.3%;不同地区绵羊的无浆体感染率为10.0%~65.7%;而不同饲养模式条件下无浆体感染率为40.7%~46.6%,无显著差异(P0.05)。说明喀什地区绵羊的无浆体感染普遍,应加强监测和防控。     

叶尔羌高原鳅外周血淋巴细胞的分离

以体质健康的叶尔羌高原鳅为研究对象,分离其外周血淋巴细胞。结果表明,采用浓度为1.085g/mL的淋巴细胞分离液在2000r/min离心35min的情况下,可将叶尔羌高原鳅外周血淋巴细胞有效地分离出来。该研究不仅为叶尔羌高原鳅淋巴细胞功能研究提供了依据,还可为叶尔羌高原鳅的疾病防治、人工养殖提供重要参考。     

牛蛙(Rana catesbeiana)皮肤cDNA文库的构建与鉴定

以牛蛙皮肤组织为材料获得总RNA,用偶联Oligo(dT)的磁珠纯化mRNA后,利用含Sfi Ⅰ酶切位点的CDSⅢ引物在逆转录酶的作用下合成cDNA的第1链,以含Sfi Ⅰ酶切位点的CDSⅢ引物和SMART引物,利用LD-PCR合成双链cDNA,双链cDNA经Sfi Ⅰ酶切,通过T4DNA连接酶连接到经过相同酶切的λTripIEx2载体,体外包装后转染E.coli XLI-Blue 宿主菌,进行滴度测试和文库扩增.结果构建的牛蛙皮肤cDNA 文库原始库容量为1.42×106 PFU/mL,插入片段长度在0.5～1.5 kb,重组率为89.5%,扩增后的文库滴度为1.35×109 PFU/mL,构建的文库质量符合要求,可用于大规模的功能基因分析.     

阿克苏地区某规模化奶牛场牛结核抗体的监测及分析

试验旨在为阿克苏地区牛结核的防控提供基础数据。试验在2020—2021年间于阿克苏地区某规模化奶牛场采集全血3 215份（2020年1 668份和2021年1 547份）,对采集的全血分离血清,使用牛结核抗体快速检测卡（胶体金法）对血清进行抗体阳性率检测,并对检测结果进行比对分析。结果显示,2020年共计检测1 668份不同繁殖状态样品,阳性样品23份,可疑样品3份,阳性率为1.38%;其中妊娠奶牛阳性率最高,为2.03%。2021年共计检测1 547份不同繁殖状态样品,阳性样品35份,可疑样品5份,阳性率为2.26%;其中妊娠奶牛阳性率最高,为2.26%。2020年共计检测1 577份不同月龄样品,阳性样品23份,可疑样品3份,阳性率为1.46%;其中6～10月龄奶牛阳性率最高,为1.82%。2021年共计检测1 477份不同月龄样品,阳性样品35份,可疑样品5份,阳性率为2.37%;其中6～10月龄奶牛阳性率最高,为2.84%。2020年共计检测874份不同胎次样品,阳性样品20份,可疑样品3份,阳性率为2.29%;其中7胎以上奶牛阳性率最高,为5.56%。2021年共计检测777...     

嗜水气单胞菌喹诺酮类药物抗性决定区基因片段的克隆与突变分析

将分离到的4株对环丙沙星，诺氟沙星和氧氟沙星等喹诺酮类药物耐药的嗜水气单胞菌、2株敏感菌，进行旋转酶基因A亚单位（gyrA)喹诺酮抗性决定区基因（QRDR）PCR扩增。引物序列A1:agagttcctatcttgattacg;a2:ctgtgatgtaggtcatcaact，在gyrA基因中的位置分别为53-73和620-640。PCR扩增后，将扩增产物克隆到pMD-18T载体，酶切鉴定后测序。用DNAstar软件分析比较其蛋白序列，发现4个氨基酸突变位点，分别是83位点的Ser-Ile（4株耐药菌），92位点的Leu-Met(4株耐药菌），174位点的Ile-Phe(3株耐药菌），202、203位点的Asn、Leu-Asp、Arg（3株耐药菌，另1株Leu未突变）。83位点的突变与大肠杆菌等一致，122位点具有保守的Try，耐药菌突变后的氨基酸残基分子量均比对应增大。4株耐药菌、2株敏感菌的喹诺酮抗性决定区基因片段序列巳登录GenBank，注册号AY039655，AY039656，AY138539，AY138540，AY138537，AY138538。     

一株β-溶血菌的鉴定

旨在通过细菌16SrRNA鉴定分离得到的一株β-溶血细菌(B1)。提取菌株B1的基因组DNA,利用细菌16SrRNA的通用引物扩增B1菌株的16SrRNA,测序并对序列进行比对分析。结果成功扩增出B1菌株的16SrRNA,条带很亮且无杂带,阴性对照无条带,条带大小为1 499bp,符合16SrRNA 1 500bp的要求;利用NCBI数据库的Blast工具进行核酸比对,结果显示B1菌株与Aneurinibacillus migulanus菌的16S rRNA序列的一致性在99%以上,通过进化树分析可知,B1与Aneurinibacillus migulanus strain A72,Aneurinibacillus migulanus strain ATCC 9999这2种菌株的亲缘关系最近,可以确定B1菌株为短芽孢菌属的Aneurinibacillus migulanus。     

新疆多浪羊IL-1β基因原核表达载体的构建与表达

【目的】构建新疆多浪羊IL-1β基因编码区的原核表达载体,在大肠杆菌中进行诱导表达,为进一步研究IL-1β蛋白的结构功能奠定基础。【方法】从含质粒pMD-18T-IL-1β的大肠杆菌DH5α中获取IL-1β基因,与pET-28b质粒DNA连接,构建原核表达载体pET-28b-IL-1β。先将其转化到克隆载体E.coli DH5α感受态细胞中大量拷贝,经菌液PCR和EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定后,提取pET-28b-IL-1β质粒转化到表达载体E.coli BL21(DE3)中,再次进行菌液PCR和EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定。将阳性单克隆接种于LB液体培养基,以终浓度为1mmol/L IPTG进行诱导,用SDS-PAGE电泳检测IL-1β蛋白的表达及存在形式,通过Western blotting验证表达产物是否为目的蛋白。【结果】成功构建了新疆多浪羊IL-1β基因的原核表达载体pET-28b-IL-1β,该载体经诱导后表达出融合蛋白,分子质量为32.4ku,主要以包涵体的形式表达;经Western blotting检测,带有6×His标签的融合蛋白有很好的反应原性。【结论】成功构建了新疆多浪羊IL-1β基因的原核表达载体pET-28b-IL-1β,其在大肠杆菌BL21(DE3)中经诱导后表达出分子质量约为32.4ku的IL-1β融合蛋白。