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【目的】利用CRISPR/Cas9技术建立绵羊示踪脐带间充质干细胞系,为间充质干细胞的临床治疗与分化机制研究奠定基础。【方法】根据绵羊ROSA26的基因组序列,利用在线工具ZiFiT Targeter Version 4.2设计合成3对引物,利用点突变法,以px330质粒为模板分别进行PCR,DpnⅠ去除质粒DNA后,PCR产物自身环化,酶切测序鉴定,构建以绵羊Rosa26为靶标基因的sgRNA/Cas9载体,构建的质粒含Cas9和向导RNA(single-guide RNA,sgRNA) 表达盒,由U6启动子驱动表达。将上述载体分别利用脂质体转染绵羊脐带间充质干细胞(sUMSCs),提取其基因组PCR后进行T7E1酶切,琼脂糖电泳分析条带灰度以检测载体编辑活性。根据sgRNA序列在绵羊ROSA26靶位点的上下游设计并合成左、右同源臂扩增引物,提取绵羊全基因组为模板分别进行PCR扩增得到左右同源臂,回收纯化后分别与pMD19-Simple连接,酶切测序鉴定获得左、右同源臂重组质粒。根据PCR引入的酶切位点,将左同源臂质粒和Donor表达载体DC-DON-SH02 ROSA26进行酶切连接,鉴定获得左臂重组打靶载体,使用相同方法将右同源臂质粒连接到左臂打靶载体上,鉴定获得Donor打靶载体,载体携带嘌呤霉素抗性基因和绿色荧光蛋白(GFP)报告基因。在生长良好的sUMSCs中加入不同浓度的嘌呤霉素,观察细胞存活时间,确定最佳抗性筛选浓度和时间。利用脂质体共转sgRNA/Cas9载体和Donor载体到绵羊间充质干细胞,在其ROSA26位点切割DNA双链,在DNA断裂处通过同源重组方式引入报告基因,转染48 h后进行嘌呤霉素抗性筛选,筛选结束后更换正常培养基继续培养,观察绿色荧光的表达并提取阳性细胞基因组,针对ROSA26位点设计上下游两对引物对其进行PCR检测其整合情况。【结果】(1)针对绵羊Rosa26位点设计3对PCR引物,利用点突变法将sgRNA 克隆至px330的BbsⅠ酶切位点上,成功构建sgRNA/Cas9载体px330-sgRNA1/2/3,将其分别转染sUMSCs,T7E1酶切结果表明px330-sgRNA2/3出现脱靶现象,未在靶位点发生编辑,px330-sgRNA1的编辑效率最高,约为20%;(2)基于sgRNA1,PCR法获得打靶载体的左、右同源臂,经一系列分子生物学方法先后连接到载体DC-DON-SH02 ROSA26上,经酶切和PCR鉴定,成功获得绵羊ROSA26位点的重组载体sROSA26-HA;(3)筛选得到sUMSCs最佳抗性浓度时间,利用Lipofectamine2000共转染sgRNA/Cas9载体和Donor重组载体到sUMSCs,1.5 μg·mL-1嘌呤霉素筛选15d至对照组细胞全部死亡,获得的阳性克隆并扩大培养。显微镜下可观察到明显的绿色荧光,且与对照组相比,阳性细胞克隆的基因组PCR均检测到特异条带,表明sUMSCs的ROSA26位点发生同源重组,GFP基因被成功敲入到基因组中并能正常表达,该细胞可以用于动物疾病模型中追踪sUMSCs的去向和分化方向的研究。【结论】成功利用CRISPR/Cas9系统在sUMSCs内实现外源GFP基因的定点敲入,获得绵羊示踪脐带间充质干细胞系,为间充质干细胞进一步的临床转化奠定了基础。 相似文献
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83.
84.
以甘肃、新疆2种不同种源的黑果枸杞(Lycium ruthenicum)种子为材料,将2种中性盐(NaCl、Na_2SO_4)按照一定比例混合,保证各盐溶液pH值均为7.0的条件下,模拟出5个浓度梯度(0、50、100、150、200 mmol/L)盐胁迫;另将2种中性盐(NaCl、Na_2SO_4)和2种碱性盐(NaHCO_3、Na_2CO_3)分别按照不同比例混合,配制成不同pH值的混合盐溶液,比较不同盐碱胁迫处理下不同种源黑果枸杞种子萌发状况。结果表明,在中性盐的胁迫下,低浓度的盐胁迫对黑果枸杞种子萌发具有促进作用,在种子萌发过程中各项萌发参数随着中性盐浓度的增加而降低,而高浓度胁迫对种子具有一定的迫害性。在不同pH值的盐碱胁迫下,2个种源种子萌发的变化趋势相同并具有显著差异,各项萌发参数随着pH值的增大而降低。甘肃种源在盐、碱胁迫下的发芽参数基本上高于新疆种源,相对盐害率低于新疆种源,表明甘肃种源种子具有较强的抗逆与抗盐碱能力。 相似文献
85.
为了筛选出有利于荔枝贮藏的复合保鲜剂,以‘井岗红糯’荔枝果实为试验材料,通过正交试验研究了不同浓度的油菜素内酯(brassinolide, BL)和曲酸(kojic acid, KA)配比对采后荔枝果实的保鲜效果。结果表明,在25 ℃贮藏条件下,对荔枝果实的最佳保鲜配方为:油菜素内酯40 μmol/L、曲酸35 mmol/L,浸泡时间为3 min,该复合保鲜剂配方能较好地抑制荔枝果实褐变和腐烂,降低果皮相对电导率、果皮pH和果皮丙二醛(malonaldehyde, MDA)含量,延缓果肉总可溶性固形物(total soluble solids, TSS)和维生素C(vitamin C, VC)含量的下降,维持较高的果皮色度L *值、a *值、C *值和花色苷含量,抑制了多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)、过氧化物酶(peroxidase, POD)及漆酶(laccase, Lac)的活性。 相似文献
86.
87.
黏膜及其表面的共生菌群是鱼类抵御外界不利环境的第一道屏障。为探索养殖罗非鱼表皮和鳃黏膜共生菌菌群的结构特征是否与其健康状况间存在相关关系,本研究运用高通量测序技术,以无乳链球菌腹腔注射攻毒48 h后存活和濒死尼罗罗非鱼为检测对象,检测攻毒前后罗非鱼表皮和鳃黏膜共生菌群落结构差异。结果显示,健康尼罗罗非鱼表皮和鳃黏膜共生菌均存在优势菌群,主要为特吕珀菌属、硫杆菌属、弓形杆菌属、海单胞菌属和弧菌属。人工感染无乳链球菌后存活尼罗罗非鱼表皮和鳃黏膜共生菌菌群与感染前无显著差异;与存活组相比,濒死尼罗罗非鱼的表皮和鳃黏膜共生菌菌群多样性下降,其中弓形杆菌属、假交替单胞菌属、海单胞菌属、假单胞菌属和弧菌属等含量显著下降,链球菌属含量占总菌群的55.30%±1.24%,表明养殖尼罗罗非鱼表皮和鳃黏膜共生菌群落结构可能与其健康状况相关。 相似文献
88.
不同增殖方式来源的绿潮藻浒苔藻体生长及光合生理特性差异 总被引:1,自引:0,他引:1
为了探讨原位状态下不同增殖方式得到的绿潮藻浒苔生物体的差异,通过原位围隔实验,分别获取漂浮浒苔释放的孢子萌发形成的藻体(ST)和浒苔自身营养增殖得到的藻体(VT),通过比较这两种浒苔的生长、光合作用和荧光参数的不同,来估测其光合生理特性的差异。结果表明,ST的生长速率比VT显著高出61.27%,并且ST的最大光合作用速率(Pmax)、光合效率(α)和光合活性(P/R)比VT分别显著高出25.33%、14.93%和134.69%,而呼吸作用速率和光补偿点比VT显著低了45.7%和52.2%,这表明ST与VT相比具有更大的生长优势。另外,VT的相对电子传递速率(rETR)显著高于ST,在高光下尤为显著,并且VT在高光下具有更高的非光化学猝灭(NPQ)能力,这说明浒苔通过自身营养增殖产生的藻体对高光的适应能力比其由孢子萌发形成的藻体更强。 相似文献
89.
为研究中国土壤系统分类(CST)体系下均腐土不同亚纲土壤细菌群落结构的多样性,以 4个干润均腐土[富牧西系(DFm)、春雷南系(DCl)、保国系(DBg)、明水系(DMs)]和 4个湿润均腐土[大西江系(MDx)、新发北系(MXf)、卫星农场系(MWx)、裴德系(MPd)]的腐殖质层(Ah层)为研究对象,采用高通量测序技术研究细菌群落多样性,分析细菌群落结构与环境因子间的关系,以探讨影响均腐土不同亚纲群落结构的主要环境因子。结果表明:均腐土 8个土系样品共获得 1 674 634条基因序列,Shannon指数和 Chao1指数表现为:干润均腐土 >湿润均腐土。均腐土 8个土系细菌群落主要包括 10个门类,其中变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)为富牧西系、春雷南系、保国系、大西江系、新发北系、卫星农场系、裴德系优势菌门,明水系以绿湾菌门(Chloroflexi)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)为优势菌门;属水平上,均腐土各土系的群落差异较大。样品热图分析将 8个土系细菌群落聚为 2类,其中干润均腐土聚为一类,湿润均腐土聚为一类。pH、交换性 Ca、CEC、交换性 Mg、SOC和 TP是影响均腐土细菌群落结构发生变化的主要因子( P<0.05)。此外,RDA分析发现,土壤 pH为影响均腐土细菌群落结构的主导因子,而 pH、交换性 Ca、CEC为驱动干润均腐土细菌群落结构发生变化的主要影响因素,交换性 Mg、SOC、TP为驱动湿润均腐土细菌群落发生变化的主要影响因素。 相似文献
90.
小麦钾离子通道蛋白基因TaPC1介导植株抵御低钾逆境功能研究 总被引:1,自引:1,他引:0