脊尾白虾3个野生群体线粒体COI基因的遗传多样性及其系统发育分析

采用PCR扩增技术对脊尾白虾的莱州湾、海洲湾、象山湾的3个野生群体共计62个个体的线粒体COI基因片段进行扩增和测序,获得长度为658 bp核苷酸序列.62条序列T、C、A、G和A+T的平均含量分别为31.53％、22.63％、27.30％、18.53％和58.83％,A+T含量显著高于G+C含量,这一结果与甲壳类、双壳贝类等的COI线粒体基因片段中的观察结果相似.通过统计变异位点、核苷酸多样性指数和平均核苷酸差异数进行基因序列变异分析.AMOVA分析表明,3群体间总遗传分化系数Fst=0.3611(P＜0.01),群体间存在较高的遗传分化,其中象山湾群体与莱州湾群体之间的遗传分化系数最高,莱州湾群体与海洲湾群体之间的遗传分化系数最低.另外用MEGA4.0软件中的NJ法构建分子进化树,同时由NCBI下载同源序列,探讨了长臂虾亚科几个种的系统进化关系,用NJ法构建的系统树显示,脊尾白虾不同单倍型先与长臂虾属和小长臂虾属聚为一支,然后与沼虾属聚为一支.     

不同地理群体三疣梭子蟹非特异性免疫功能的比较

本文测定了海州湾、辽东湾、舟山沿海和莱州湾4个野生群体三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）的血淋巴、肌肉和肝胰腺组织中的抗氧化及其它与非特异性免疫相关的酶活指标,并对这些指标在不同群体间的差异进行了比较。结果发现：海州湾群体的三疣梭子蟹肝胰腺SOD酶活显著高于莱州湾群体（P<0.05）,而与其它两个群体差异不显著;而血淋巴和肌肉组织SOD酶活各个群体间差异均不显著（P>0.05）。海州湾群体血淋巴和肝胰腺组织GSH-px酶活显著高于莱州湾群体（P<0.05）,而与其它群体差异不显著（P>0.05）。不同地理群体三疣梭子蟹各体组织中MDA含量、LSZ和ALP酶活均没有显著性差异（P>0.05）。本文全面比较了4个地理群体三疣梭子蟹免疫相关酶活指标的差异,揭示了不同地理群体三疣梭子蟹免疫、抗病能力差异的内在因素。     

脊尾白虾血蓝蛋白基因cDNA的克隆与表达分析

应用RACE技术克隆了脊尾白虾血蓝蛋白基因全长cDNA序列,并对该序列进行了分析.结果显示,该基因全长2 158 bp,开放式阅读框长1 992 bp,5’非编码区长26 bp,3’非编码区长140 bp,将该基因命名为EcHc.EcHc编码663个氨基酸,前15个氨基酸组成信号肽,推测成熟肽的分子量为75.05kDa.Blast比对结果显示,由脊尾白虾血蓝蛋白cDNA序列推导的氨基酸序列与日本沼虾、信号小龙虾血蓝蛋白氨基酸序列的同源性分别为86％、68％,由此推断该cDNA序列可能属于血蓝蛋白家族.利用Real-time PCR方法,分别研究了鳗孤菌和白斑综合征病毒(WSSV)感染脊尾白虾后,肝胰腺组织中EcHc基因在不同时间点的表达变化.实验结果表明,细菌或病毒感染后,EcHc基因在肝胰腺组织中的表达量显著增加,且均在感染后6h达到最高值,揭示脊尾白虾血蓝蛋白基因EcHc在脊尾白虾的免疫防御中具有重要作用.     

pH、氨氮胁迫对中国对虾HSP90基因表达的影响

研究了pH、氨氮胁迫对中国对虾Fenneropenaeus chinensis血细胞、肝胰腺、鳃和肌肉组织HSP90基因时空表达的影响.分别将中国对虾暴露于pH7.0、9.0的水体中148h和不同氨氮浓度的水体中96h,结果表明,pH（7.0,9.0）胁迫条件下中国对虾鳃、肌肉和血细胞HSP90基因表达均上调,肝胰腺HSP90基因表达对两种pH胁迫差异明显：pH7.0胁迫条件下,HSP90基因表达3h达峰值后明显降低;pH 9.0胁迫时,HSP90基因表达水平逐渐升高,整个胁迫过程中均显著高于对照组（P＜0.05）,说明中国对虾肝胰腺组织是高pH胁迫的响应器官.6mg/L氨氮浓度组鳃和肌肉组织HSP90基因表达水平24h达最高值,分别为对照组的5.46和1.55倍;各胁迫组肝胰腺和血细胞HSP90基因表达水平分别于6h和48h达到最高值,为对照组的1.33～2.08倍和2.20～5.45倍.肝胰腺组织对氨氮胁迫表现敏感,短时间内（6h）通过上调HSP90基因表达水平保护细胞;鳃组织HSP90基因表达波动范围最大,说明鳃组织需要更高表达量的HSP90保护细胞.当氨氮浓度持续48～96h维持在2～6mg/L,各组织HSP90基因表达水平显著降低.     

脊尾白虾全人工繁育技术初步研究

脊尾白虾是我国沿海地区池塘养殖重要品种,但目前尚未实现全人工繁育,严重制约了产业进一步发展。选取野生脊尾白虾作为亲虾,经过越冬培育、促熟交尾、幼体孵化培育、仔虾选育等手段,进行了脊尾白虾全人工繁育技术研究。试验结果显示,在盐度31.3、水温18.1~26.2℃、pH 8.1条件下,室内越冬脊尾白虾亲虾可成功培养至性腺成熟,并交尾抱卵,平均抱卵率达70%,平均孵化率为61.02%。幼体最佳培育密度20尾/L,仔虾适宜养殖密度0.13~0.53尾/L,培育至2cm时存活率可达80%,继续培育3个月后发育至性成熟。一年可繁殖2~3代。在此基础上建立了脊尾白虾近交家系,现已培育至第6代,各家系繁殖力、生长速度和存活率均未出现近交衰退现象。本研究初步解决了脊尾白虾室内全人工繁育技术,并为试验动物培育奠定了良好的技术基础。     

Vc对中国对虾非特异免疫因子及TLR/NF-κB表达量的影响

为了解Vc的免疫机制,以中国对虾为实验动物,对其投喂添加不同Vc含量(0%、0.5%、1%、2%)的饲料,进行存活率、iNOS、CAT、LZM酶活性及TLR、NF-κB表达水平的比较。结果发现:(1)饲喂Vc的不同处理组提高了中国对虾的存活率、iNOS、CAT及LZM活性,其中1%添加组存活率达90.28%,显著高于其他组。(2)Vc可以调节TLR、NF-κB在血清及鳃中的表达水平。1%添加组血清、鳃中TLR的表达水平相对于各自的对照组表现出显著性差异(P<0.05)。TLR、NF-κB在组织中的表达趋势并不一致。1%组血清中NF-κB的表达水平高于对照组,其他两组的表达水平始终位于对照组之下,而2%添加组鳃中的表达水平高于其他三组,说明Vc可以调节这两个免疫基因的表达,在中国对虾的免疫应答中发挥重要作用。     

脊尾白虾水通道蛋白基因4和11在碱度胁迫过程中的作用

水通道蛋白(aquaporin)是一种细胞膜上特异性转运水分子及其他中性代谢分子的膜蛋白家族,对生物的细胞内外渗透压稳定具有重要的调节作用。为了了解水通道蛋白在脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)应对碱度胁迫中的作用,本研究利用RACE技术成功克隆了脊尾白虾水通道蛋白4 (aquaporin 4, EcAQP4)与水通道蛋白11 (aquaporin 11, EcAQP11)基因cDNA全长,EcAQP4基因的开放阅读框为621 bp,编码206个氨基酸,预测分子量为21.673 kDa,理论等电点为8.30,为疏水性蛋白,具有5个跨膜结构域;EcAQP11基因的开放阅读框长度为783 bp,编码260个氨基酸,预测蛋白分子量为28.490 kDa,理论等电点为5.40,为疏水性蛋白,具有4个跨膜结构域。序列比对结果显示,EcAQP4基因与罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)同源性最高,为94.63%;EcAQP11与斑节对虾(Penaeus monodon)同源性最高,为81.47%。为验证水通道蛋白的功能,利用RNA干扰技术特异性沉默EcAQP4和EcAQP11基因,结果显示,碳酸盐碱度胁迫后,注射干扰后的脊尾白虾死亡率显著升高,EcAQP4干扰组72 h死亡率达到45%,EcAQP11干扰组72 h死亡率达到55%,与对照组差异显著(P<0.05)。同时发现,EcAQP4干扰组在碳酸盐碱度胁迫24、48与72 h时的血液渗透压变化幅度显著高于对照组(P<0.05),72 h时渗透压显著升高(P<0.05);EcAQP11干扰组血液渗透压在3个时间点均显著升高(P<0.05)。以上结果表明,水通道蛋白在脊尾白虾应对碱度胁迫过程中起到了调节渗透压、维持体内外离子平衡的作用。     

车前种子黏液对其劣变和萌发抗逆性的影响

本研究以保留黏液和去除黏液的车前（Plantago asiatica）种子为试验材料,分别对其进行人工老化处理和模拟的干旱、盐胁迫处理,然后在最适萌发温度下进行萌发测试,旨在从种子生活力保持和萌发抗逆性角度阐释种子黏液对萌发成苗的影响。结果表明：在老化过程中,保留黏液种子比去除黏液种子提前4 d发生萌发率的显著下降;与去除黏液种子相比,保留黏液种子萌发对水势的下降更为敏感,但其萌发率随水势下降的速率却相对缓慢;两种种子萌发在耐盐胁迫方面差异不大,仅在中等浓度盐溶液（75 mmol·L^-1 NaCl）培养下,保留黏液种子的萌发速率显著高于去除黏液种子。总之,车前种子黏液物质的存在,一方面不利于种子生活力的保持,加速其老化,另一方面,在一定程度上提高了种子萌发对轻微干旱胁迫和盐胁迫的抗性。     

pH胁迫对3种对虾存活率、离子转运酶和免疫酶活力的影响

比较研究了中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）、凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）和日本囊对虾（Marsupenaeus japonicus）在对照组（pH 8.2）、低pH胁迫组（pH 7.2）和高pH胁迫组（pH 9.2）养殖水体条件下的存活率、鳃离子转运酶（Na⁺-K⁺-ATPase）活力及血淋巴iNOS、PO、SOD、GSHPX、LSZ活性。结果表明：对照组3种对虾的存活率整个实验期间均为100％;低pH和高pH胁迫条件下,日本囊对虾存活率分别为96.7％和97.0％;凡纳滨对虾存活率分别为60.1％和54.6％,中国明对虾的存活率分别为58.6％和13.3％。对照组条件下,凡纳滨对虾鳃离子转运酶（Na⁺-K⁺-ATPase）活力最大,中国明对虾其次,日本囊对虾最小;在低和高pH胁迫条件下,中国明对虾鳃Na⁺-K⁺-ATPase活力变化幅度均比凡纳滨对虾大,日本囊对虾的变化幅度最小,并且3种对虾鳃Na⁺-K⁺-ATPase活力在高pH胁迫条件下变化幅度均较大。对照组条件下日本囊对虾和凡纳滨对虾血清中非特异性免疫酶活性均显著或极显著高于中国明对虾,且日本囊对虾的PO、SOD活力分别显著、极显著高于凡纳滨对虾;在低和高pH胁迫条件下,中国明对虾和凡纳滨对虾血清非特异性免疫酶的活力变化幅度均显著高于日本囊对虾。中国明对虾和凡纳滨对虾血清iNOS、SOD、GSHPX、LSZ活力在低pH条件下变化幅度较大,而PO活力在高pH条件下变化幅度较大。综合上述结果显示3种对虾相比,日本囊对虾对pH胁迫的耐受性较强,凡纳滨对虾次之,中国明对虾较弱。     

猪卵丘卵母细胞复合体和裸卵的卵母细胞发育及基因表达差异的研究

卵丘细胞是指包裹在卵母细胞外周并与之进行代谢联系的颗粒细胞群,是一类与生殖细胞密切相关的体细胞。大量研究表明,卵丘细胞在卵母细胞的发育、成熟、排卵、受精以及受精卵发育过程中发挥了重要作用,卵母细胞与卵丘细胞之间的相互作用已成为关注的焦点。由于卵丘与卵母细胞之间的相互作用十分复杂,人们对参与这一细胞间互作的信号通路和反应过程相关基因的表达还缺乏深刻了解。本研究对比了有致密完整卵丘细胞包裹的卵母细胞和无卵丘细胞包裹裸卵的体外培养成熟过程中的成熟率、孤雌激活卵裂率、囊胚率的差异,并运用mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)和半定量RT-PCR技术,比较了两者在基因表达上的差异,目的是进一步认识卵母细胞的发育机制,并推测卵母细胞和卵丘细胞间的相互作用的分子机理。材料与方法:采集大量猪的卵母细胞,捡出A级卵(胞质均匀且卵丘细胞层完整紧密,包裹五层以上的卵)和C级卵(有极少或无卵丘细胞包裹的卵)分别进行了体外培养、孤雌激活。同时对两类卵母细胞抽提RNA,进行DDRT-PCR,筛选出差异条带进行克隆测序,最后根据测序结果设计特异引物,最后通过半定量RT-PCR对筛选出的差异条带进行验证。结果与讨论:(1)在体外培养和成熟实验中,卵丘卵母细胞复合体(COC)中的卵母细胞的成熟率和卵裂率均显著高于裸卵的,而裸卵的囊胚率为0,表明卵丘细胞在卵母细胞的发育和成熟过程中起到了关键作用。(2)利用了3对锚定引物和随机引物,共发现了16条差异表达的片段,经过克隆测序最终得到了14条差异表达的序列,经过比对发现,其中3个片段分别与人的PELP1,Myo5b,calpastatin基因高度同源,另外5条序列与猪的EST同源,但功能未知,其余6条序列未找到同源片段。(3)经过半定量RT-PCR验证表明,大约有一半的条带在差异显示和半定量RT-PCR实验中的结果一致,其中PELP1,Myo5b基因在有卵丘细胞的卵母细胞中的表达量高于裸卵的,而calpastatin基因只在有卵丘细胞的卵母细胞中表达,在裸卵中则没有检测到。(4)相关研究表明,差异表达基因在雌激素受体的调节、细胞膜间的信息传导、细胞器物质运输等过程中发挥重要的作用,这些差异基因可能参与了卵丘细胞与卵母细胞间的相互作用,对卵母细胞的成熟具有重要作用。上述研究为进一步认识卵母细胞的发育机制,并推测卵母细胞和卵丘细胞间的相互作用的分子机理奠定基础。这些差异表达的基因也是卵母细胞成熟过程中的关键因子,可以作为筛选卵母细胞进行下一步操作的标记基因。