肠炎沙门菌污染鸡蛋的途径

近20年来,肠炎沙门菌(Salmonella Enteritidis,SE)是引起人类食源性沙门菌病大流行的主要病原菌之一,其传播的主要媒介是被污染的鸡蛋.鸡蛋的外壳表面和内部均可被污染.肠炎沙门菌通过两种可能途径造成鸡蛋内部污染,一是细菌穿过蛋壳造成鸡蛋的间接污染,二是细菌随着带菌生殖器官分泌物造成蛋产出前内容物的直接污染.     

抗沙门菌PEG菌毛单克隆抗体的制备及初步临床应用

为制备抗沙门菌PEG菌毛单克隆抗体(MAb),本研究从鸡白痢沙门菌(CVCC526)基因组中扩增菌毛蛋白基因peg A,将其克隆至原核表达载体pET-22b(+)中构建重组质粒pET-peg A,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白rPegA。应用该蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,经间接ELISA筛选后获得1株稳定分泌MAb的杂交瘤细胞株,命名为3D12,抗体亚类鉴定其属于IgG1亚类,腹水效价为1∶64 000。通过western blot和玻板凝集试验检测结果显示,该MAb与肠炎沙门菌、鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌呈阳性反应,而与鼠伤寒沙门菌、大肠杆菌CE2、CE7、CE53、DH5α均不发生反应。以PEG菌毛MAb建立玻板凝集方法,检测本实验室临床分离保存的72份禽源沙门菌,同时以商品化沙门菌诊断血清作为平行对照,结果两种方法符合率达97.2%。本研究研制的MAb可用于沙门菌PEG菌毛基础研究和快速检测。     

未来家禽产业的食品安全挑战

世界禽肉消费在1985～2005年间增长了250％,猪肉消费增长40％.巴西家禽产业在1997～2002年间增长了50％,出口增加超过国内消费.疾病控制、动物福利、饲养管理水平等很大程度上受限于养殖主体的基础和认知,细菌性病原的耐药性和致病性病毒的基因重组是东南亚以及南美国家面临的主要威胁.     

肠炎沙门氏菌SEF14菌毛亚单位sefA和sefD基因缺失株的致病性研究

为研究SEF14菌毛在肠炎沙门氏菌中的致病作用,本实验将SEF14菌毛亚单位编码基因缺失的肠炎沙门氏菌突变株50336△sefA和50336△sefD分别接种6周龄BALB/c小鼠和1日龄清远麻鸡,比较它们与其亲本菌株50336的致病性差异。结果显示,亲本菌株50336以及突变株50336△sefA、50336△sefD对小鼠的半数致死量分别为19.95 cfu、7.94 cfu和7.94 cfu,表明两个突变株对小鼠的致病性显著增强;而且对雏鸡的致病性结果也显示,突变株50336△sefA致病力较强,其感染雏鸡组死亡率为15%,而亲本菌株组死亡率为8.6%;另外50336△sefA和50336△sefD感染组7日龄时平均增重分别为15.38 g和18.39 g,亲本菌株组为19.06 g,对照组为26.43 g。研究结果表明SEF14菌毛亚单位基因缺失对肠炎沙门氏菌的致病性具有增强作用。     

鸭胚胎骨骼肌TR-β mRNA发育性表达及与肌重相关性研究

为探讨TR-β基因在不同品种鸭胚胎期和出雏早期胸肌和腿肌中表达的发育性变化及其对胸腿肌重的影响。采用实时荧光定量PCR方法研究了高邮鸭和金定鸭胚胎期(17,21,25,27胚龄)和出雏早期(7日龄)胸腿肌中TR-βmRNA的表达水平。结果表明,TR-β mRNA在2个品种鸭肌肉早期发育中表现出一致的表达规律,但在腿肌和胸肌的发育性变化规律稍有不同:在胚胎期胸肌和腿肌中的TR-β mRNA表达量均呈先低后高的趋势,27胚龄时表达量最高;但出壳后胸肌中的TR-β mRNA表达量出现显著下降(P<0.01),而腿肌仍维持高水平表达(P>0.05)。表明TR-βmRNA表达具有显著的胚(日)龄依赖性,并存在组织差异,但无品种差异。鸭发育早期胸腿肌中TR-βmRNA表达量与胸腿肌重的相关性分析表明,两者呈强的正相关,提示胸腿肌中TR-βmRNA的表达可能在鸭早期胸腿肌发育过程中发挥着正调控作用。     

产志贺毒素样大肠杆菌F18ab菌毛操纵子基因的体外非诱导系统的表达和鉴定

以产志贺毒素样大肠杆菌（SLTEC）F18ab血清型标准菌株107/86基因组DNA为模板,利用PCR技术成功扩增出编码F18ab完整菌毛操纵子fed基因,克隆入表达载体pBR322,经限制性内切酶酶切分析,DNA琼脂糖电泳鉴定并结合序列测定分析,构建和筛选出含fed完整基因正确插入的pBR322-fed重组质粒,将上述重组质粒转化至不含任何菌毛结构的大肠杆菌SE5000,该表达重组菌能分别与兔抗F18ab亚单位蛋白FedF高免血清、鼠抗F18ab菌毛a单因子单克隆抗体、兔抗F18ab菌毛高免血清和抗F18ab菌毛IgG抗体产生明显的凝集反应。用热抽提法分别抽提和纯化SLTEC F18ab标准株107/86和重组菌SE5000（pBR322-fed）体外表达的F18ab菌毛,纯化菌毛经SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色获单一相对分子质量约为15 000蛋白条带。Western-blotting结果表明：兔抗F18ab菌毛高免血清能特异性识别SLTEC F18ab标准株107/86和重组菌SE5000（pBR322-fed）所提纯的单一主要结构蛋白。用重组菌SE5000（pBR322-fed）进行易感仔猪小肠上皮细胞体外黏附试验和黏附抑制试验,结果表明：重组菌SE5000（pBR322-fed）和SLTEC F18ab标准株107/86一样具有较强的黏附易感仔猪小肠上皮细胞的能力,而兔抗F18ab菌毛高免血清能有效地抑制上述重组菌SE5000（pBR322-fed）和SLTEC F18ab标准株107/86对易感仔猪小肠上皮细胞的黏附结合。     

基于Red同源重组和高效自杀性载体系统构建肠炎沙门氏菌突变株方法的比较

Red同源重组系统和高效自杀性载体系统都能对革兰氏阴性茵染色体直接进行修饰,本试验利用上述2种系统敲除不同来源肠炎沙门氏茵菌株SEF14茵毛操纵子亚单位sefD或sefA基因,并对构建肠炎沙门氏茵突变株方法进行比较.本研究成功构建了国际、国内标准株,鸡源和人源国内分离株sefD和sefA缺失株各4株.Red同源重组系统中能将PCR产物一步法直接转化肠炎沙门氏茵,通过同源重组序列发生同源重组交换.但对PCR产物和感受态细胞的质量要求很高,一次重组效率很低,而二次重组过程则相对简单、高效.自杀性载体系统若将构建好的合同源DNA片段的重组质粒转化宿主茵,其一次重组效率高,二次重组也只需蔗糖筛选传代丢失抗性质粒.Red同源重组系统将在染色体中残留FRT位点;而自杀性栽体系统在染色体中可不留任何痕迹.所以2个系统都能对不同源肠炎沙门氏茵染色体进行直接修饰,而且易删除抗性选择标志,与传统的高效自杀性载体系统比较,Red同源重组系统更方便快捷,省时省力.     

鸡β-防御素-1真核表达载体构建及其在Flp-In-293细胞中的表达

以防御素为研究对象探讨其药用开发价值已是国内外生物医学研究领域的热点之一,鸡β-防御素-1（Gallinacin-1,Gal-1）对许多致病菌都具有杀菌作用,具有很好的研究开发价值。本研究以含有Gal-1成熟肽全长cDNA的重组质粒pMD19-T-Gal-1为模板,通过PCR在Gal-1成熟肽基因C末端引入6×His-tag,并将其克隆到pcDNA3.1（＋）载体中,构建真核表达质粒pcDNA3.1（＋）-Gal-1-His;经脂质体介导转染Flp-In-293细胞,48h后间接免疫荧光分析,结果重组质粒pcDNA3.1（＋）-Gal-1-His转染的Flp-In-293细胞中有绿色荧光,而阴性对照中无荧光,表明Gal-1-His在Flp-In-293细胞中得到了表达。本研究结果将为进一步研究Gal-1的功能奠定基础。     

高邮鸭和金定鸭发育早期骨骼肌MyoG和Myf6基因的表达分析

【目的】研究生肌调节因子肌细胞生成素(MyoG)和生肌决定因子(Myf 6)基因表达对鸭胚胎期及初生早期骨骼肌发育的影响。【方法】采用Real-time PCR方法研究MyoG、Myf6基因在不同鸭品种(高邮鸭和金定鸭)胚胎期(13,17,21,25,27胚龄)及初生早期(出雏后7日龄)骨骼肌发育中的表达差异,并分析其表达变化与胸、腿肌发育的相关性。【结果】MyoG和Myf6基因在2个品种鸭胸肌、腿肌组织发育早期均有表达,但不同组织存在不同的表达模式。MyoG在鸭胚胸肌、腿肌组织中均呈现"前高后低"的表达模式,21胚龄以前表达量相对较高,随后表达量下降,并维持相对较低水平;而Myf6基因在胸肌组织中在21胚龄时表达量最高,随后表达量下降,但仍维持相对较高的表达水平;在腿肌组织中在13胚龄时表达量较高,在17胚龄时达到最高,随后表达量有所降低,并在21胚龄后急速下降至极低水平,但其表达在胚胎期后期(27胚龄)以及初生期(7日龄)又有缓慢上升趋势。二元变量相关性分析结果表明,2个品种鸭胸肌、腿肌MyoG mRNA表达与胸肌、腿肌发育呈强负相关;胸肌中Myf6mRNA的表达与胸肌发育无显著相关性,腿肌中Myf6mRNA的表达与腿肌发育呈强负相关。【结论】骨骼肌中MyoG和Myf6基因表达具有显著的时空性,性别差异不显著,骨骼肌中MyoG和Myf6基因表达与鸭发育早期骨骼肌质量变化呈现负的线性相关。     

沙门菌感染后鸡不同组织中Nod1基因表达量的变化分析

采用Real-time PCR的方法检测了AA肉鸡感染沙门菌后6h和1、2、3、5、7d的胸腺、脾、法氏囊和小肠中Nod1基因的表达量,分析Nod1基因在沙门菌感染过程中的表达量变化情况,在转录水平探讨沙门菌感染对Nod1基因表达量的影响。试验分为3组,鸡白痢沙门菌组,肠炎沙门菌组和对照组。结果显示,感染组与对照组相比,在4个器官中Nod1基因的表达量在2种沙门菌感染后的一定时间内均出现了上升,表达量达到高峰的时间分别为2d(胸腺)、5d(脾脏)、2d和3d(法氏囊)及5d和7d(小肠)。结果表明,2种沙门菌感染均可激活Nod1基因表达,提示Nod1基因可能与鸡的抗感染免疫作用有关。