禽呼肠孤病毒σA基因酵母双杂交诱饵载体的构建与鉴定

为了筛选与禽呼孤病毒σA基因相互作用的宿主蛋白,本试验应用酵母双杂交技术构建禽呼孤病毒σA基因的诱饵载体pGBKT7-σA。从禽呼肠孤病毒S1133标准毒株抽提RNA,采用RT-PCR方法扩增得到σA基因片段,将其连接到诱饵载体pGBKT7上,把通过测序的重组诱饵载体命名为pGBKT7-σA。将重组诱饵载体转化酿酒酵母Y2HGold后,把不同浓度的诱饵载体转化液涂布在营养缺陷型培养基上,观察该重组诱饵载体在酵母细胞中有无毒性作用和自激活现象。结果显示,酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-σA构建成功,且对酿酒酵母无毒性和自激活现象。本研究为进一步利用酵母双杂交技术筛选与σA蛋白互作的宿主蛋白奠定了基础。     

重庆江津区土壤-稻米中硒和重金属的积累及迁移特征

【目的】为了解重庆江津区土壤-稻米系统中硒和重金属的含量及迁移特征,明确土壤硒与重金属元素的相互关系。【方法】选择江津区水稻生产规模较大4个镇,于水稻收获季节布点采集水稻及根系表层土壤,测定土壤-稻米中硒和重金属的含量。【结果】江津区受试区域88.9%土壤硒含量达足硒和富硒水平,59.3%稻米达到富硒大米的标准。土壤与稻米中的Se和重金属Cd、Pb、Cr、As、Hg的相关系数分别为0.045、-0.118、0.132、0.102、0.371~(**)(P0.01)、0.102,土壤中As与稻米中As含量成极显著正相关关系。稻米对硒和重金属富集能力为:Cd SeHgAs CrPb。【结论】江津区具有开发富硒稻米的潜力,但研究区内水稻对Cd和Se的富集能力较强,存在潜在重金属污染,要充分利用研究区土壤硒资源,生产安全且富硒的稻米,需要解决Cd超标的问题,同时要密切关注土壤As的污染情况。     

重庆稻田土壤重金属污染特征分析及风险评价

【目的】探究重庆稻田土壤重金属元素的含量特征并对其进行风险评价,为土壤重金属污染防控及耕地土壤保护提供参考依据。【方法】采集重庆市7个典型水稻主产区的稻田土壤样品230个,分析测定土壤样品的pH及Cd、Hg、As、Pb、Cr等5种重金属元素含量,利用内梅罗污染指数评价法与地累积指数评价法进行污染程度分析,并与重庆土壤重金属背景值和农用地土壤风险筛选值进行比对,分析评估重庆稻田土壤重金属污染特征,再通过皮尔逊相关性分析和聚类分析探究土壤重金属污染可能来源。【结果】研究区土壤中Pb、Cd、Cr、As、Hg等5种重金属元素的平均含量分别为25.4、0.312、66.8、4.71、0.0827 mg/kg。通过单因子污染指数与内梅罗污染指数评价法分析,研究区稻田土壤有19.57%的点位处于Cd元素轻污染状态,0.43%的点位处于Hg元素中污染状态,其余点位处于无污染状态。地累积指数分析发现,稻田土壤中Cd处于轻污染水平,其余重金属元素属于无污染水平,但存在极少部分土壤的Hg元素地累积指数极高(4.03,属于强-极强污染等级)。与重庆市土壤背景值比对发现,Cd、Hg元素含量均超过了重庆土壤背景值...     

基于血清4型禽腺病毒fiber-1蛋白间接ELISA检测方法的建立

为了获得血清4型禽腺病毒(fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)fiber-1重组表达蛋白,并建立快速鉴别检测方法,本试验将FAdV-4 fiber-1基因连入pET-32a表达载体,转化BL21(DE3)感受态细胞,将测序正确的重组蛋白经IPTG诱导表达、纯化和Western blot鉴定。以纯化的pET-32a-fiber-1重组蛋白作为ELISA包被抗原,优化反应条件,建立了检测FAdV-4抗体的fiber-1-ELISA方法。结果成功表达pET-32a-fiber-1蛋白,证实可与FAdV-4阳性血清特异性结合,具有良好的反应原性。特异性结果显示,除FAdV-4与FAdV-10外,与其他病原的抗体无交叉反应;阳性血清稀释1 600倍仍可检测到,批内和批间最大变异系数均小于10%。检测了176份临床样品,75份为阳性,101份为阴性。fiber-1-ELISA方法易于操作,特异性强,重复性好,为FAdV-4抗体监测提供了有效方法。     

H4亚型禽流感病毒套式RT-PCR检测方法的建立

旨在建立一种快速、准确检测H4亚型禽流感病毒(AIV)的方法,针对H4亚型AIV HA基因保守序列,设计并筛选出2对特异性引物,通过优化反应条件,建立了H4亚型AIV套式RT-PCR检测方法。特异性试验结果显示,该法可特异性检测出H4亚型AIV,对其他常见禽病病原体无交叉;敏感性试验结果显示,该法对H4亚型AIV检测下限为360fg/μL;用该法对106份临床样品进行检测,临床样品检测结果与病毒分离结果一致。本研究建立的套式RT-PCR方法为H4亚型AIV的早期诊断及有效防控提供了快速、特异和敏感的检测方法。     

H6N1亚型禽流感病毒GeXP检测方法的建立

根据基因库中H6亚型禽流感病毒(AIV) HA基因、N1亚型AIV NA基因和所有亚型AIV M基因序列,分别设计筛选出3对特异性引物,优化反应条件,建立了H6N1亚型AIV GeXP检测方法。该法对H6亚型AIV的检测出现194 bp (H6)、164 bp (AIV通用检测) 2个目的峰,对N1亚型AIV的检测出现249 bp (N1)、164 bp 2个目的峰,对H6N1亚型AIV的检测出现194 bp、249 bp和164 bp 3个目的峰,对其他亚型AIV的检测只出现164 bp通用检测目的峰,对常见禽病病原体均未出现任何检测峰;该法对H6亚型和N1亚型AIV检测下限为102拷贝/μL。本研究建立的H6亚型和N1亚型AIV高通量GeXP检测方法特异性强、灵敏度高,可同时快速鉴别检测H6亚型、N1亚型和所有亚型AIV,为H6N1亚型AIV的检测提供了一种简便、快速和有效的方法。     

牛支原体、牛病毒性腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒三重二温式PCR检测方法的建立及应用

为建立一种可同时检测牛支原体(MB)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛传染性支气管炎病毒(IBRV)的三重二温式PCR检测方法。根据GenBank中MB、BVDV和IBRV的保守基因Uvrc基因、5′端非编码区(5′-UTR)和GB基因,分别设计了3对特异引物,将三温式PCR扩增程序简化为两个温度梯度,优化反应条件建立了用于同时检测MB、BVDV以及IBRV 3种常见牛呼吸道传染病病原的三重二温式PCR。结果显示,该方法特异性好,只对MB、BVDV和IBRV模板进行扩增,扩增的目的片段长度分别为412、170、727bp,对其他牛病原体无特异性扩增;灵敏度高,最低能同时检测到10 000拷贝的目的核酸;干扰性小,能同时检测3个不同浓度的模板。研究所建立的MB、BVDV和IBRV三重二温式PCR检测方法,具有特异性好、灵敏度高、方便快速等优点,可用于临床鉴别诊断和流行病学调查,具有很高的临床应用价值。     

应用二重实时荧光定量RT-PCR鉴别坦布苏病毒与产蛋下降综合征病毒

为更加快速敏感地对两种导致产蛋下降的禽类病毒:坦布苏病毒和产蛋下降综合征病毒进行鉴别,试验建立了一套二重实时荧光定量RT-PCR方法。通过针对两种病毒的特异保守序列,设计两套引物和探针,分别标记不同的荧光基团和淬灭基团,并优化反应体系。结果显示:建立的二重实时荧光定量RT-PCR方法只扩增这两种病毒的目的片段,无交叉扩增反应,与其他常见禽类病原体也无扩增反应;该检测体系最低可同时检测100个拷贝的坦布苏病毒和产蛋下降综合征病毒,比常规PCR和RT-PCR敏感10~100倍;检测30份样品,共检出7份EDSV阳性,6份TMUV阳性,与病毒分离结果符合。表明建立的二重实时荧光定量RT-PCR方法可以快速、敏感、特异地鉴别诊断坦布苏病毒和产蛋下降综合征病毒。     

Taqman探针荧光定量RT-PCR检测禽肺炎病毒方法的建立

本试验旨在研究建立Taqman探针实时荧光定量RT-PCR检测禽肺炎病毒的方法.根据C亚型禽肺炎病毒F基因序列,设计了1对针对C亚型禽肺炎病毒的特异性引物和1条用荧光基团标记的Taqman探针,建立实时荧光定量RT-PCR检测C亚型禽肺炎病毒的方法,并对建立的方法进行敏感性、特异性测定和临床样品检验.结果显示该方法能特异性地鉴别检测禽肺炎病毒,特异性好;敏感性可检测到10个拷贝的禽肺炎病毒质粒DNA模板;对收集的54份鸡肺病料样品进行检测,没有检测到C亚型禽肺炎病毒阳性病料,与常规RT-PCR检测和病毒分离结果吻合.本研究建立的实时荧光定量RT-PCR方法检测C亚型禽肺炎病毒具有特异、敏感、快速、定量等优点,该方法适合用于检测鸡中C亚型禽肺炎病毒的存在.     

鸡新城疫不同免疫程序的抗体水平测定及攻毒保护试验

为了解不同免疫程序下鸡新城疫的抗体水平变化规律及攻毒保护效果,本试验设计了四组不同的免疫程序及一组空白对照,通过在5日龄、14日龄、21日龄、28日龄、35日龄、42日龄、49日龄、56日龄、63日龄、70日龄监测新鸡城疫的HI抗体水平,同时用新城疫抗体试验盒检测了ELISA抗体水平,各组鸡在14日龄、28日龄、42日...