微滴式数字PCR定量检测禽脑脊髓炎病毒方法的建立

旨在建立微滴式数字PCR(ddPCR)检测禽脑脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus, AEV)的方法,并实现对AEV绝对定量检测。根据已发表的AEV的VP1基因为靶序列,在其保守区域内设计了特异性扩增的引物和探针序列,应用合成的引物和探针建立ddPCR检测AEV方法,并测定其特异性、灵敏性和重复性。结果显示,建立方法的最佳引物终浓度为1.0μmol/L,探针终浓度为0.5μmol/L,退火温度为58℃。特异性测试结果,本方法只检出AEV,没有检出禽流感病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽呼肠孤病毒、禽偏肺炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒,且无交叉反应。灵敏性结果显示,本方法对pMD18-AEV重组质粒DNA最低检测限为5.9拷贝/μL,敏感性高。用4个连续稀释的pMD18-AEV重组质粒DNA的拷贝数的对数值与ddPCR检测的拷贝数的对数值绘制绝对定量曲线,其曲线呈良好的线性关系(R²=0.999 4),结果稳定。3次重复检测结果的变异系数均小于5%,重复性好。对采集的病鸡临床样品65份进行ddPCR和荧光定量PCR检测,结果...     

禽源HSP70、HSP40和RPL4基因的克隆和表达

本研究参照GenBank中编码禽源热休克蛋白HSP70、HSP40和核糖体蛋白RL4等的基因序列,分别设计特异性引物,采用RT-PCR扩增HSP70、HSP40和RPL4基因,经双酶切后克隆到真核表达载体pEF1α-Myc,得到重组质粒pEF1α-Myc-HSP70、pEF1α-Myc-HSP40和pEF1α-Myc-RPL4;将构建好的重组质粒,转染HEK293T细胞后,采用间接免疫荧光和Western-blot技术,对目的蛋白进行验证。结果表明,Myc-HSP70、Myc-HSP40和Myc-RPL4融合蛋白在HEK293T细胞内得到了正确表达。本研究为后续禽源HSP70、HSP40和RPL4基因的功能研究奠定了基础。     

鸡胚成纤维细胞cDNA文库构建及其与禽呼肠孤病毒σA相互作用宿主蛋白的筛选

[目的]构建鸡胚成纤维细胞(CEF)的cDNA文库并筛选与禽呼肠孤病毒(ARV)σA蛋白相互作用的宿主蛋白,为揭示互作蛋白对ARV复制及凋亡的分子调控机制打下基础.[方法]采用TRIzol法提取CEF细胞总RNA,以SMART技术和LD-PCR合成双链cDNA(ds cDNA),ds cDNA和pGADT7-Rec共转化Y187酵母感受态细胞,构建cDNA文库;将pGBKT7-σA诱饵质粒转至Y2HGold酵母感受态细胞中,并与构建的cDNA文库进行酵母双杂交筛选,筛选出的候选文库菌经质粒提取后与pGBKT7-σA诱饵质粒再共转化Y2HGold酵母菌,筛选出能在SD-/Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba固体培养基上生长且明显变蓝的菌落,最后提取蓝色酵母菌质粒进行测序分析.[结果]构建的CEF细胞cDNA文库库容为1.6×106 CFU,文库滴度为3.1×108 CFU/mL,插入片段大小集中在300~2000 bp,重组率为91.67%.以含有pGBKT7-σA的Y2HGold酵母菌与cDNA文库酵母菌进行双杂交,阳性克隆能在SD-/Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba(SD/-4/X/A)固体培养基上长出菌落且明显变蓝,测序结果显示共筛选出4个能与σA蛋白相互作用的宿主蛋白,分别是初期多肽相关复合体α亚基(NACA)、核苷二磷酸激酶2(NME2)、假定蛋白及线粒体核糖体蛋白S9(MRPS9).[结论]通过SMART技术构建的CEF细胞cDNA文库具有较好的库容和滴度,且从cDNA文库中筛选出4种与ARVσA蛋白相互作用的宿主蛋白,为后续研究互作蛋白对ARV复制及凋亡的分子调控机制提供了可靠数据.     

基于生态系统服务价值评价的四川南河国家湿地公园优化策略研究

为科学评价四川南河国家湿地公园建设成效,并进一步提出国家湿地公园优化策略,本文利用单位面积生态系统服务价值当量表,计算了四川南河国家湿地公园2005年至2018年生态系统服务价值变化。结果表明:四川南河国家湿地公园生态系统服务价值逐年增加,增长率达到40.4%,其中气候调节、生物多样性、美学景观和土壤保持方面价值增长率分别是330.7%、267.0%、201.1%和193.9%,气体调节、原料生产、维持养分循环、净化环境、水资源供给、水文调节增长率分别是176.9%、120.2%、94.2%、71.4%、31.7%、18.5%。基于以上研究,本文提出结合功能区划,逐步增加湿地面积,完善生态结构的优化策略。     

H4、N2和所有亚型禽流感三重RT-PCR检测方法的建立

为建立一种同时检测H4、N2和所有亚型禽流感的方法,分别针对H4亚型禽流感病毒(AIV) HA基因、N2亚型AIV NA基因和所有亚型AIV M基因保守序列,设计筛选出3对特异性引物,优化引物之间的浓度,对三重反应体系进行特异性和敏感性验证,建立了H4、N2和所有亚型AIV三重RT-PCR检测方法,并用该法对临床样品进行检测。建立的方法能特异性扩增H4、N2和所有亚型AIV,与其他禽病病原体不发生交叉反应;对H4、N2和所有亚型AIV至少能检测到6 pg/μL。在185份临床样品的检测中,检出4份H4、10份N2和19份AIV阳性。所建立的三重RT-PCR方法特异性强、灵敏度高,为快速检测H4、N2和所有亚型AIV提供了有效的方法。     

2株广西鹅源基因XII型新城疫病毒的病原学分析

【目的】深入了解2株广西鹅源基因XII型新城疫病毒(NDV)的病原学特征,为NDV流行分布的系统监测和新城疫(ND)的科学防控提供参考依据。【方法】对2株广西鹅源基因XII型NDV(Goose/China/GX02/2018和Goose/China/GX17/2018)进行病毒噬斑纯化,通过致死鸡胚平均死亡时间(MDT)和脑内接种致病指数(ICPI)试验确定其致病性,分析F蛋白和HN蛋白氨基酸序列与参考毒株的差异位点,并基于F基因全长进行遗传进化分析。【结果】经过DF-1细胞4个代次噬斑纯化可获得2株分离株的纯化株,对应的MDT分别为54和48 h,ICPI均为1.65。2株分离株的基因组长度均为15192 nt,其3’端引导序列为55 nt,5’端尾随序列为114 nt;基于F基因核苷酸序列相似性构建的基因XII型NDV系统发育进化树显示,2株分离株(Goose/China/GX02/2018和Goose/China/GX17/2018)均属于基因XIIb亚型,与我国广东分离株属于同一基因亚型,且我国2010年的分离株、2011年的分离株及2017年后的分离株分别形成3个小分支。2株...     

禽呼肠孤病毒σ3基因在烟草中的表达与鉴定

【目的】研究禽呼肠孤病毒S1基因编码的σ3基因在烟草中的表达及其表达产物的反应原性。【方法】根据Gen Bank中公布的禽呼肠孤毒株S1133的基因序列,设计特异引物扩增σ3基因,构建重组植物表达载体p BI121-σ3,热激法转化农杆菌EHA105感受态细胞,筛选含有重组质粒的p BI121-σ3的阳性工程菌株EHA105。采用农杆菌介导的叶盘法转化野生型烟草,卡那霉素筛选获得抗性植株。随后通过σ3基因的特异引物,PCR方法初步筛选获得转σ3基因的烟草植株。进一步对阳性植株通过实时荧光定量PCR方法检测σ3基因在转基因烟草中的拷贝数,以烟草自身单拷贝的内源基因核糖核酸还原酶-RNR2作为内参基因,通过梯度稀释分别构建RNR2及σ3基因的起始模板量和对应CT值的标准曲线,通过检测样品中σ3基因和RNR2基因模板量对数值的比值估算出σ3基因在转基因烟草中的拷贝数。并通过Western-blotting方法对转基因烟草中表达的σ3融合蛋白的反应原性进行分析。【结果】1通过双酶切和测序验证表明σ3基因插入位置、大小和读码框均正确,表明σ3基因已经成功的构建于植物表达载体p BI121的花椰菜花叶病毒(Ca MV)35S启动子的下游,以NOS为终止子,含有卡那霉素抗性标记(NPT II)。其表达的蛋白与下游的绿色荧光蛋白形成融合蛋白,其大小约为61.6 ku;2在转化筛选抗性植株的过程中采用350 mg·L-1的头孢霉素可以很好地抑制农杆菌的污染,100 mg·L-1的硫酸卡那霉素筛选压力能够很好地抑制非转化细胞的生长;3随机选取10株转化烟草进行PCR检测发现8株转化烟草可以扩增到清晰的目的条带约994 bp;4内参基因RNR2的标准曲线为y=-3.5352x+15.143,σ3基因的标准曲线为y=-3.5366x+1.8265,两个标准曲线的相关系数均接近于1。在检测的5株转化烟草中σ3基因的拷贝数均为4,阴性对照没有扩增。5Western-blotting显示σ3融合蛋白在转化烟草中可以正确表达,目的条带大小约为61.6 k D,与预计大小一致;σ3融合蛋白能够与禽呼肠孤病毒的阳性血清发生特异反应,表明该融合蛋白具有良好的反应原性。【结论】成功地构建了植物表达载体p BI121-σ3,筛选获得低拷贝的转σ3基因的烟草,σ3融合蛋白能够在烟草中表达且具有相应的反应原性,为进一步研究σ3基因的功能和利用植物作为生物反应器生产σ3蛋白口服疫苗的研发奠定了基础。     

检测猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒的二重荧光LAMP方法的建立

建立一种二重荧光LAMP的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒(PCV)的快速诊断技术。根据已发表的PRRSV NSP2基因和PCV2 ORF2基因序列保守区域,分别设计并合成了两组针对PRRSV和PCV2序列的特异性引物和两条探针,两条探针分别标记不同的荧光基团,PRRSV-Probe 5’端标记FAM荧光基团,3’端标记BHQ1淬灭基团,PCV-Probe 5’端标记CY5.5荧光基团,3’端标记BHQ2淬灭基团。对组成反应体系中的引物、探针以及反应试剂进行优化,建立了二重荧光LAMP检测PRRSV和PCV2方法。对建立的方法进行特异性和敏感性测试,并用模拟混合样品和临床样品进行检测验证。结果显示,本研究建立的方法可以鉴别区分PRRSV和PCV2,特异性试验表明该方法只检测出PRRSV或PCV2,且与参试的对照病毒无交叉反应,特异性好。敏感性测试表明该方法最低检测PRRSV或PCV为100拷贝,敏感性好。对临床样品的检测,结果与荧光定量PCR方法检测结果一致。本研究建立的PRRSV和PCV2二重荧光LAMP检测方法,具有良好的特异性和敏感性,可用于临床样品中检测PR...     

禽呼肠孤病毒RT-RPA-LFD快速检测方法的研发

禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)主要感染鸡和火鸡,引起关节炎、腱鞘炎等症状。为满足疾病早期快速诊断的需求,建立一套应用重组聚合酶核酸等温扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)检测ARV的方法,使用侧向流动免疫试纸条(lateral flow dipstick,LFD)观测结果。首先针对ARV较为保守的片段M1基因设计数套引物,使用普通RT-PCR筛选出一套无非特异条带、敏感性优良的引物组建立ARV RT-RPA-LFD反应体系,优化探针浓度和反应温度,使用建立的反应体系进行特异性和敏感性试验,最后以最低检测模板浓度优化反应时间。结果显示,建立的ARV RT-RPA-LFD反应体系在探针工作浓度为0.12 mmol/L,37℃条件下反应20 min,可最低检测到1.5×10¹ copies/反应的ARV RNA,并且不与其他常见禽病原体核酸发生反应。使用建立的方法检测40份临床病料,发现有3份ARV阳性,与之前本实验室建立的二重qRT-PCR检测结果一致。结果表明,本研究建立的ARV RT-R...     

基于GT-POWER柴油机稳态工况下排放性能仿真研究

通过GT-POWER建立了单缸直喷柴油机仿真模型,利用该软件的控制模块,通过对PID控制的比例、积分和微分的参数的合理整定,实现了发动机稳态工况的控制。通过改变喷油提前角和喷油嘴的喷孔长径比两个参数,分析了该发动机的排放性能,并进行了参数的优化选择。