槟榔基因组DNA的高效提取方法

以槟榔叶片为植物材料,采用改良的SDS-CTAB方法提取其基因组DNA。结果表明,以水饱和酚代替Tris饱和酚对样品进行抽提的SDS-CTAB法可以获得纯度高(OD260/OD280在1.7~1.9、OD260/OD230大于2)、一级结构完整、分子量大于23 kb的DNA,产率在50~120μg/g。该法所提DNA成功用于后续的分子生物学研究,并在花生、香蕉等植物上得到应用。     

关于加强南繁育种公共科技服务体系建设的建议

南繁育种公共科技服务体系是南繁硅谷运行的重要保障.文章阐述了南繁公共科技服务体系概况,分析了南繁科技公共科技服务体系存在的问题,并从准确把握南繁公共科技服务的内涵、完善南繁公共科技服务的手段和坚持南繁企业的主体地位等方面提出了促进南繁公共科技服务体系建设的建议,旨在为国家南繁硅谷建设提供借鉴和参考.     

新疆盐生植物猪毛菜逆向运输蛋白基因SaNHX1 3’-RACE的克隆及序列分析

以新疆盐生植物猪毛菜(Salsola collina Pall.)为材料提取总RNA,根据NHX1家族同源序列保守区设计1对简并引物,进行RT-PCR扩增,得到猪毛菜逆向运输蛋白基因cDNA中间一段619 bp序列。再用快速扩增cDNA 3’末端(3’RACE)方法,得到约1 000 bp 3’末端序列。将两段序列进行拼接,得到猪毛菜长为1 585bp(Gen Bank登陆号为EU072932)的逆向运输蛋白基因(SaNHX1)cDNA序列,编码370个氨基酸,其编码序列、氨基酸序列与同科耐盐植物盐角草相应序列同源性为85%和87%,研究为进一步克隆猪毛菜NHX1全基因序列和研究其功能打下基础。     

感染高粱花叶病毒甘蔗叶片cDNA文库构建及评价

为了研究甘蔗花叶病与甘蔗寄主致病的互作分子机制,利用SMART技术成功构建了感染高梁花叶病毒甘蔗叶片的cDNA文库,用于后续酵母双杂交互作蛋白筛选试验.采用Omega公司Plant RNA Kit提取感染高粱花叶病毒甘蔗叶片总RNA,经过Oligotex纯化获得mRNA,将其反转录成cDNA第一链,再在DNA聚合酶作用下,通过长距离PCR扩增双链cDNA.经SfiI酶切并去除短片段后,连接到pGADT7-SfiI载体上,成功获得初级cDNA文库,最后以初级文库100万克隆为基数扩增,得到扩增文库并提取质粒.经检测构建的文库容量为1.6×106 cfu,文库滴度2.2× 106 cfu/mL,文库cDNA插入片段长度主要分布在700～2 000 bp,文库重组率约为96％.结果表明,该文库质量较好,为筛选分离抗病功能基因及开展寄主与病毒互作的研究奠定了基础.     

海南蔗区甘蔗黄叶病与花叶病发生情况的分子鉴定

于2010年甘蔗生长季节,对海南甘蔗产区8个县(市)24个乡镇进行甘蔗病毒病的调查和检测,初步明确海南蔗区甘蔗病毒病种类主要有2种,即由甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus,ScYLV)引起的甘蔗黄叶病和由高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)引起的甘蔗花叶病。其中甘蔗黄叶病最为普遍,检出率达到75%,可能是影响海南蔗区甘蔗产量的重要因素之一,而由高粱花叶病毒引起的甘蔗花叶病次之。同时针对甘蔗病毒病提出推广甘蔗脱毒健康种苗是其防治的主要措施,对指导海南蔗区乃至全国甘蔗生产具有重要的意义。     

香蕉束顶病毒海口分离物Rep基因的克隆、原核表达、抗血清制备及检测

［目的］ 对香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)海口分离物起始蛋白(replication initiation proteins, Rep)基因进行克隆、原核表达、抗血清制备,为BBTV有效的检测及分子流行病学等研究奠定基础。［方法］ 以海口地区染病香蕉幼嫩假茎和叶片的总DNA为模板,通过PCR技术克隆BBTV海口分离物的起始蛋白基因,连接到表达载体并进行大肠杆菌原核表达,制备高效价特异性抗血清。［结果］ 应用PCR方法从染毒香蕉幼嫩假茎和叶片总DNA中扩增复制rep基因,回收目的片段后经酶切,获得了含BBTV Rep基因的重组质粒pET32b Rep。将重组质粒转化E.coli BL21(DE3),经不同的时间、温度及IPTG浓度优化,12% SDS PAGE电泳分析,在20 ℃、0.1 mmol/L IPTG条件诱导4h,最终获得大量的可溶性融合蛋白。将可溶性蛋白上清液经Ni2+ NTA亲和层析柱纯化,得到高纯度的融合蛋白。用纯化后的融合蛋白免疫家兔,获得了BBTV Rep蛋白抗血清。以融合蛋白做抗原,间接ELISA法测定抗血清效价大于125 000。以田间样品做抗原时,结果表明抗血清最佳工作浓度为1∶1 000。Western blot鉴定结果表明抗血清能与融合蛋白特异性结合。［结论］ 利用Rep基因制备的特异性抗血清在BBTV病毒粒体的组装机制研究及病毒病诊断上具有重要的应用价值。     

黄瓜花叶病毒2b基因在大肠杆菌中的表达及其自激活特性检测

2b蛋白是黄瓜花叶病毒与植物寄主相互作用的一种重要多功能蛋白。用PCR方法扩增目的基因2b,经酶切、连接将其克隆至带有λcI基因的pBT载体上,构建与λcI基因融合的表达载体pBT-CMV 2b,转化大肠杆菌XL1-Blue MRF′报告菌株,用IPTG诱导表达黄瓜花叶病毒2b基因。Western blot分析结果表明,2b-λcI融合蛋白已成功表达,大小约为38 ku,与预期大小一致。pBT-CMV 2b与空质粒pTRG共转化XL1-Blue MRF′报告菌株,同时以pBT空质粒和pTRG-Gal11p共转化作为对照。结果显示,CMV 2b蛋白未产生自激活作用,从而为利用大肠杆菌双杂交系统筛选与2b蛋白相互作用的蛋白质研究奠定基础。     

槟榔黄化病叶片差异表达蛋白筛选与鉴定

以相同品种,树龄、长势一致的黄化病槟榔和健康槟榔叶片为试材,采用TCA(三氯乙酸)/丙酮法制备蛋白质样品,结合双向电泳-质谱结合技术,分析病原菌-槟榔互作后差异表达蛋白。结果表明,双向电泳SDS-PAGE胶中黄化病槟榔叶片与健康叶片平均蛋白质点数分别为1081个和960个,其中差异明显的点34个。选择5个差异蛋白点进行质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定,并进行数据库查询,结果鉴定了2个蛋白质,分别为核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶和蕈状支原体高同源蛋白,这些蛋白质可能参与了槟榔黄化病发生和发展过程。另外3个蛋白点在数据库中未检索到同源性和匹配率较高的蛋白质,认为是未知蛋白。     

玉米螟细胞色素P450家族CYP6AE25的克隆及序列分析

摘要：昆虫细胞色素P450是一类在生物代谢中起重要作用的基因家族,承担着许多重要的生理功能,包括对植物次生物质代谢和杀虫剂的解毒等。本研究以玉米螟5龄幼虫总RNA为模板,根据不同昆虫P450基因家族保守氨基酸序列,设计并合成简并引物,利用RT-PCR扩增出了玉米螟细胞色素P450基因的中间片段,通过RACE技术获得玉米螟P450基因家族一员全长序列,将其克隆到pMD19-T载体进行序列测定。测序获得了编码523个氨基酸残基的2315 bp的全长cDNA,命名为OfP450(GenBank登录号：EU807990)。国际P450命名委员会将其定为CYP6AE25。本文还从生物信息学角度对CYP6AE25进行分析,分别从蛋白的理化性质、结构组成、信号肽、跨膜结构域、二级结构、三级结构与功能结构域等作了较为详细的分析与预测。进一步研究其高级结构与功能的关系提供理论依据。CYP6AE25蛋白与其它P450分子进化树分析结果显示,与昆虫CYP6家族同源性较高,与CYP其他家族的遗传距离较远,同源性较低。     

应用多重RT-PCR检测甘蔗黄叶病毒和高梁花叶病毒

建立了多重RT-PCR同时检测甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus,ScYLV)和高梁花叶病毒病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)的技术体系,该体系可有效地对甘蔗田间植株和试管苗进行检测.根据引物之问的互补性及引物的Tm值筛选多重PCR引物.确定适宜的PCR缓冲液的...