大肠杆菌glgC基因的定点突变及高效表达

通过PCR方法,从E.coliJM109基因组DNA中扩增到全长为1296bp的glgC基因,对其进行定点突变,获得第296位和336位氨基酸同时突变的glgC336基因。将2者亚克隆进pET-30a,成功构建了重组表达载体pET-C和pET-C336,转化大肠杆菌BL21(DE3),在1mmol/LIPTG诱导下进行表达。SDS-PAGE电泳分析显示,在约53kD处有1条明显的蛋白表达带,证明目的基因已得到高效表达,且重组蛋白表达量占菌体蛋白总量的77.3%。     

玉米幼胚愈伤组织诱导及再生

利用综3、87-1、郑58、昌7-2、137和K12等6个骨干自交系玉米幼胚进行愈伤组织诱导并建立再生体系。结果显示,2,4-D对玉米幼胚愈伤组织的诱导形成是必需的,浓度在2.0～2.5 mg/L;6-BA不利于愈伤组织的形成,但能促进幼胚直接长芽、长根,尤其以郑58最明显。材料综3、郑58、K12诱导愈伤组织比较容易,诱导率均≥85%;材料137和87-1表现中等,诱导率约在50%～60%;材料昌7-2表现最差,愈伤组织诱导率≤25%。     

pCAMBIA2300-betA-BADH双价基因植物表达载体的构建

将载体pCAMBIA2300-35s-OCS进行改造,增加了酶切位点Sac Ⅰ,之后,PCR扩增编码胆碱脱氢酶(CDH)的基因并用Sma Ⅰ和Xba Ⅰ将其与改造后的pCAMBIA2300-35s-OCS连接,得到单价植物表达栽体p2300-gz-betA.再通过Sal Ⅰ、Hind Ⅲ、Sac Ⅰ等酶切位点将编码甜菜碱醛脱氧酶(BADH)的基因及其启动子和终止序列连接到栽体p2300-gz-betA上,最终得到pCAMBIA2300-betA-BADH双价植物表达载体,并将其导入根癌农杆菌GV3101和LBA4404.betA和BADH是编码甜菜碱合成途径的两个关键酶的基因(CDH和BADH),也是近年来研究较多的耐盐基因,其双价植物表达栽体应用于遗传转化后,有望进一步提高转基因植物的耐盐性.     

不同基因型马铃薯试管薯的诱导及其再生研究

以陇薯3号(L3)、陇薯6号(L6)、新大坪(XDP)和渭薯1号(W1)的脱毒试管苗为试验材料,进行微型薯的诱导及其薯片再生研究.结果表明,在全黑暗条件下采用液体MS+8%蔗糖为培养基,所有品种都诱导出了微型薯,但不同基因型的马铃薯诱导效果明显不同.综合分析单瓶结薯数、薯块大小、微型薯产量和大薯率等几个指标,诱导微型薯由易到难的顺序是XDP>W1>L6>L3.试管微型薯片再生频率由高到低的顺序是L3>L6>W1>XDP.     

定植密度和施肥种类对蕨菜生长及产量的影响

蕨菜[Ｐｔｅｒｄｉｕｍａｑｕｉｌｉｎｕｍ(Ｌ.)Ｋｕｈｎ]是野生于天然林区的一种蕨科蕨属多年生宿根性草本植物,因其幼嫩茎叶富含多种对人体有益的维生素、胡萝卜素和铁锌等微量元素,自古以来被人们视为山珍采摘食用。近年来,随着人民生活的改善和对外贸易的扩大,蕨菜又成为内销外贸的抢手货,并且需求量不断增加。由此导致了对野生蕨菜连年过量采摘,加之人畜践踏破坏,资源锐减,产量下降,再完全依赖自然生产已越来越不能满足需求。为此,国内外近年开展了有关蕨菜原生地人工驯化栽培工作(齐乐贤,1991;吴会胄等,1994),但蕨菜人工异地栽培的报…     

马铃薯地上部绿色组织中糖苷生物碱合成调控的研究

为提高马铃薯品种(系)地上部分糖苷生物碱(SGAs)的含量,增强其抗逆性并改良块茎的品质。克隆了马铃薯茄啶鼠李糖基转移酶基因(sgt3)cDNA和1,5–二磷酸核酮糖羧化酶小亚基基因启动子(rbcS P);对sgt3亚细胞定位预测显示,该蛋白不具有叶绿体转运肽、线粒体导肽和分泌信号肽序列,推测可能位于细胞质;将克隆的sgt3 cDNA片段及rbcS重组到pCEPSP载体上,构建了具有草甘膦抗性标记的绿色组织特异表达sgt3基因植物表达载体。通过农杆菌介导法对马铃薯品种‘陇薯3号’和‘夏波蒂’进行转化,共获得了12株抗草甘膦的阳性转基因植株。对转基因植株的目的基因表达水平和SGAs含量分析发现,地上部sgt3基因相对表达量较未转化植株提高1.3~3.0倍,SGAs含量增加20%~37%,而转基因植株的块茎中SGAs含量变化不显著。本研究的结果为进一步培育枝、叶中高SGAs而块茎中低SGAs的马铃薯抗性品种提供了理论依据。     

导入Chi—linker—Glu和Bar基因获得抗真菌和抗除草剂的转基因烟草

构建重组表达载体pBIb—CG（含有Chi-linker—Glu融合基因和Bar基因）,利用农杆菌介导法将其携带的Chi—linker—Gm融合基因和B4r基因转化烟草（Nicotiana tobaccumL）品种红花大金子。经根癌农杆菌侵染和共培养后,用100mg／LKan＋500mg／LCef筛选抗性芽．获得30株抗性植株,抗性植株再生率为37％：分别对抗性再生植株中Chi一砌ker—Glu融合基因和Bdr基因的特异性引物进行PCR检测,结果27株为阳性,占90％。PCR、Souchem杂交结果证明,外源基因已整合到烟草基因组中。离体抑菌试验和除草剂抗性试验表明,转基因烟草植株对木霉菌fTricko derma viride）、镰刀菌（Fusarium solanif sppisii）和除草剂都表现出一定的抗性。     

西北地区耕地土壤真菌DNA提取方法比较

由于西北土壤理化性质的复杂性和真菌特殊性,所以从土壤中提取真菌基因组DNA就相对细菌更困难。在2种常用的土壤微生物基因组DNA提取方法与在传统提取方法的基础上,结合了一种专门适用于真菌的提取方法进行了比较,并且利用真菌28SrDNA通用引物U1/U2进行扩增。三种提取方法比较结果表明:SDS法提取的DNA纯度最低,传统CTAB-SDS的DNA产量最低,实验室的提取方法既可以提高DNA产量又可以保证DNA的片段完整性,并且本实验室的提取方法扩增效果最好,可广泛应用于西北地区土壤真菌的分子生物学研究。     

马铃薯糖苷生物碱的抑菌活性及其对菌体细胞膜透性的影响

【目的】通过探究马铃薯糖苷生物碱对几种经济林病原真菌的抑菌活性及其可能的作用机理,为其在植物病害的无公害防治应用中提供理论依据.【方法】采用生长速率法,测定其对3种常见经济林植物病原真菌:腐皮镰刀菌(Fusarium solani),核桃盘二孢(Marssonina juglands),煤炱菌(Capnodiume leaophilum)的抑菌活性,并以腐皮镰刀菌为试材,应用电导仪测定其对菌体细胞膜通透性的影响.【结果】当马铃薯糖苷生物碱质量浓度为2g/mL时的抑菌效果最好;其中对腐皮镰刀菌的抑菌活性最强,其EC50为0.268 0g/mL,煤炱菌次之,对核桃盘二孢(Marssonina juglands)抑菌活性最弱,EC50为1.490 7g/mL;通过菌体细胞液电导率的测定,发现马铃薯糖苷生物碱作用下,腐皮镰刀菌菌体的相对渗透率增加了25.2%.【结论】马铃薯糖苷生物碱提取液对3种供试真菌均具有一定的抑菌活性,以对腐皮镰刀菌的抑制效果最佳,并引起其菌体细胞膜透性的增强.     

玉米逆境响应基因ZmGST23克隆和表达分析

谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferases,GSTs)是植物抗氧化系统的重要成员,在初生代谢、次生代谢、细胞信号转导及逆境响应等生物学过程中发挥着重要作用.本研究以GenBank中公布的玉米谷胱甘肽-S-转移酶23基因(ZmGST23)mRNA序列(GenBank登录号:NM_001111524)为依据,采用RT-PCR方法从玉米(Zea mays)自交系F83中克隆得到ZmGST23基因669 bp的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),编码222个氨基酸,蛋白分子量为24.84kD,理论等电点为5.68.保守结构域分析表明,该基因具有GSTs所特有的N端及C端结构域,并含有典型的G位点及H位点,属于Tau类谷胱甘肽硫转移酶.系统进化分析表明,ZmGST23编码蛋白与高粱(Sorghum bieolor)GST蛋白亲缘关系最近,且在不同物种间存在明显的种属特性.启动子序列分析结果显示,ZmGST23基因启动子区含有多个响应逆境及植物激素的作用元件,包括脱落酸(abscisic acid,ABA)响应元件、生长素(auxin,IAA)响应元件、赤霉素(gibberellin,GA)响应元件、厌氧响应元件、防御及逆境响应元件以及干旱诱导的MYB转录因子(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog,MYB)结合位点.胁迫诱导表达分析表明,ZmGST23的表达显著受干旱脱水、水涝、盐、ABA、IAA、GA、低温及高温等非生物胁迫的诱导.组织特异性表达分析表明,ZmGST23基因在幼芽和成熟叶片中表达量较高,在幼根、花丝、苞叶、雌穗及雄穗中表达量较低,存在明显的组织特异性.将ZmGST23基因片段连接至原核表达载体pEASY-E1中,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21,用0.5 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ3-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达1～4 h后获得30 kD的诱导蛋白.本研究结果为进一步利用该基因进行玉米抗性改良提供了一定的理论依据.