猪瘟兔化弱毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

【目的】建立一种能够实际应用于猪瘟兔化弱毒疫苗中猪瘟病毒含量检测的荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中登录号为AF091507的猪瘟病毒(CSFV)兔化弱毒株的全长基因组序列,在其5′非编码区设计2对特异性引物(标准品引物、定量引物)和1条探针(qPCR-P),通过标准品引物进行RT-PCR扩增及T7 RNA聚合酶体外转录构建标准品RNA。对荧光定量PCR方法的各项条件进行优化,建立猪瘟兔化弱毒荧光定量PCR检测方法,并采用该法对成品猪瘟兔化弱毒疫苗中的病毒含量进行检测。【结果】成功构建了体外转录的标准品RNA,建立了检测猪瘟兔化弱毒的荧光定量PCR方法。该方法检测灵敏度可达10拷贝/μL,比RT-nPCR方法的灵敏度高出1个数量级;该法对标准品RNA检测的线性范围为1.0×108~1.0×102拷贝/μL。对1.0×108,1.0×106,1.0×103拷贝/μL 3种稀释度的标准品RNA进行重复性试验,批内变异系数分别为0.54%,0.52%和0.39%;批间变异系数分别为1.47%,1.85%和1.01%,具有良好的可重复性。应用该方法对不同厂家猪瘟兔化弱毒疫苗中的病毒含量进行测定,可知同一厂家脾淋苗中的病毒含量比细胞苗高出1~2个数量级,而不同厂家同一类型疫苗中病毒含量也有差异,其中脾淋苗差异不大,而细胞苗间的差异较大,最高可达27.2倍。【结论】建立的猪瘟兔化弱毒荧光定量PCR方法,具有敏感性高、特异性强、重复性好的特点,为实际工作中对猪瘟兔化弱毒疫苗的质量监控提供了重要的技术支撑。     

猪瘟流行野毒株E_2基因编码的gp55蛋白模拟分析

利用RT-PCR和PCR技术扩增出近期猪瘟流行野毒株的E2基因,将其克隆到载体上测定核苷酸序列,根据Alfort株和Brescia株、C-株确定起始氨基酸三联体的正确位置后推导出其氨基酸序列,结果表明近期流行的猪瘟毒株与疫苗毒株和强毒株之间存在一定差异;利用DNAstar软件分析E2基因编码的gp55蛋白的疏水性、抗原性和二级结构,并与猪瘟疫苗毒株(C-株)进行比较,结果表明,目前流行的猪瘟病毒与疫苗毒的gp55蛋白在抗原性、二级结构上存在一定的差异,而C末端疏水性差异不大。     

如何建立肉品安全全程质量控制体系

一、我国在肉品安全性方面存在的主要问题 改革开放以来，我国的社会生产力得到了空前高速度的发展，国民经济持续、稳定增长、人民的物质生活水平得到了很大的提高．动物性食品的消费量不断增加．从而有力地促进了我国养殖业的发展：近年来．我国畜禽的年饲养量分别为：猪9亿～10亿头、牛1.5亿～1.8亿头．羊4.5-4.8亿头，家禽约100亿只．其中猪．禽的饲养量，     

不同月龄青年奶牛血浆性激素水平的比较

采用放射免疫分析方法,测定了16头15至19月龄青年奶牛发情周期血浆中孕酮、17β—雌二醇和睾酮的含量。结果表明,15、16、17及19月龄青年奶牛的三种性激素含量差异均不显著(P>0.05)。说明青年奶牛在15月龄时,其卵巢的内分泌功能就已经健全。     

侧柏裸根苗和容器苗造林对比试验

选择适宜造林树种和造林方法是提高干旱山区造林成效的主要途径之一。为此 ,1 997年至 1 999年 ,结合太行山绿化工程建设进行了侧柏不同苗木的造林对比试验。现总结如下 :1　试验地概况试验地设在井陉县天长镇核桃园村 ,30 7国道南侧的半阴坡 ,坡度 1 8度 ,基岩为石灰岩 ,土层厚 2 0 cm,属于干旱山区。2　试验材料和方法2 .1　试验材料(1 )侧柏裸根苗 ,1 a生 ,平均苗高 2 5 cm,主根长 3～ 5 cm,侧根 3～ 6条。(2 )侧柏容器苗 ,1 a生 ,平均苗高 35 cm,容器为直径 1 0 cm、高 1 5 cm的塑料袋。2 .2　试验方法本试验设计了裸根苗造林和容器苗造…     

RNAi技术与生物医学研究进展

随着基因组计划的实施，人类步入生物医学研究的崭新时代——后基因组时代，人们的关注点开始集中于革命性的基因新技术，RNA干扰（RNA interfereqce，RNAi）技术就是倍受关注的一个焦点。RNAi现象是指通过与内源性mRNA编码区某段序列同源的双链RNA（dsRNA）特异性抑制靶基因的转录后表达而引起的基因沉默现象。     

猪血管内皮细胞体外生长特性的研究

试验以体外分离培养的猪血管内皮细胞为材料，研究了细胞的生长曲线、不同基础培养基对细胞生长的影响及胰岛素在生长液中的适宜含量。结果表明，传代猪血管内皮细胞接种后有ld左右的滞留期，然后细胞进入对数生长期，可持续2d，第5d进入平台期，第8d细胞开始脱落死亡；与MEM相比，M-199更适合于用作培养猪血管内皮细胞的基础培养基；在不用贴附基质和内皮细胞生长因子(ECGF)的条件下，生长液中加入胰岛素，可明显促进细胞的生长和增殖，胰岛素的最适用量为8μg／mL。     

重组猪瘟病毒E2基因逆转录病毒载体的构建及其表达活性

从实验感染兔脾组织中提取总RNA，应用RT—PCR得到了CSFVC-株结构蛋白E2基因，定向克隆于逆转录病毒载体pBABEpuro，经PCR、酶切和序列分析鉴定，获取阳性重组质粒。将该重组质粒与水疱性口炎病毒载pVSV—G共转染GP2—293细胞，收获假型病毒，并在Polybrene的介导下感染PK15细胞，嘌呤霉素筛选表达猪瘟E2基因的细胞株。通过细胞传代并结合PCR、免疫荧光及ELISA检测表明，所筛的细胞细胞系能稳定表达猪瘟E2基因，而且表达产物具有良好的生物学活性。     

家兔子宫内膜细胞和平滑肌细胞的分离培养

本试验旨在体外分离培养兔子宫内膜细胞(腺上皮细胞和基质细胞)和平滑肌细胞,并且探讨纯化子宫内膜上皮细胞和基质细胞的方法。用差速离心法和差速贴壁法获得纯化的子宫内膜上皮细胞和基质细胞,用滤网法分离得到子宫平滑肌细胞,分别在添加20%胎牛血清(FBS)、100μg/mL牛胰岛素、63.5 nmol/L雌二醇(E2)、7.14nmol/L孕酮(P4)的DMEM/F12(1∶1)培养液和37℃5%CO2的饱和湿度条件下培养;用免疫组化和免疫荧光法鉴定细胞并检测分离的细胞纯度。结果表明用该方法成功地分离培养了兔子宫内膜上皮细胞和基质细胞,且2种细胞纯度都达98%左右,基质细胞出现蜕膜化;子宫平滑肌细胞的纯度为97%左右,而且出现横纹状的生长。本研究表明子宫内膜细胞和平滑肌细胞能够在体外成功培养;在含20?S、100μg/mL牛胰岛素、63.5 nmol/L E2、7.14 nmol/L P4的DMEM/F12(1∶1)培养液和37℃5%CO2饱和湿度的培养条件下最有利于体外培养的子宫内膜细胞和平滑肌细胞的生长。     

鸵鸟生殖激素IEMA和RIA测定方法的比较研究

鸟类血浆生殖激素测定，可查阅的资料包括鸡、鸭、鹌鹑和火鸡等家禽，Allan Degen（1994）测定了雌雄鸵鸟的几种生殖激素年周期的变化，作者对不同繁殖状况的鸵鸟主要生殖激素进行测定，均采用放射免疫分析（radiate immunoassay，RIA）法测定。有关磁性分离酶联免疫分析（magnetic enzyme immunoassay，IEMA）生殖激素在人上有很多报道，将这种方法应用于鸟类激素的测定还未见报道。本研究采用IEMA测定法分别测定鸵鸟血浆中的FSH、LH、17β-E2和P4激素水平变化，并与RIA测定法进行比较，分析两种方法在测定生殖激素的关系，探讨IEMA法测定鸟类生殖激素的可行性。