靶向猪瘟病毒NS3基因shRNA干扰载体的构建与鉴定

利用RNA干扰在线生物学软件分析猪瘟病毒NS3基因,设计针对NS3基因不同位置的小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰序列(其结构特征为正链(19nt)-环(9nt)-负链(19nt))。化学合成这些序列,并退火连接为双链干扰片段,将双链干扰片段定向克隆到干扰载体中,构建重组载体pGene-NS3-1,pGene-NS3-2和pGene-NS3-3,转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,对转化产物进行kan+筛选,碱裂解法提取重组质粒,将酶切鉴定为阳性的质粒测序。结果显示,双链干扰片段克隆方向正确,序列中未出现核苷酸的插入,缺失等突变现象。表明靶向猪瘟病毒NS3基因shRNA干扰载体构建成功。     

含NDV F48E9株F基因的MDV CVI988株转移质粒载体的真核表达

为进一步提高重组病毒的表达水平,用构建的含gB启动子和NDV F48E9株F基因的MDV CVI988株转移质粒载体pUS10F转染293T细胞,通过PCR和接免疫荧光(IFA)法研究了其在真核中的表达,并确定最佳的转染条件。结果表明,真核细胞中带有F基因,转移质粒载体已经进入细胞DNA;转染转移质粒载体 pUS10F后的293 T细胞所表达的NDV F基因产物抗原性较好,能够与抗NDV的标准血清反应。确定的最佳转染条件为:DNA 3μg／mL,转染后48 h外源基因在细胞中的表达量最高,在6孔板和96孔板中细胞数量分别以 2×105／孔和1×101／孔的转染效果最好。     

猪瘟病毒石门株NS3基因在大肠杆菌中的表达

采用PCR技术,扩增了猪瘟病毒石门株NS3基因的丝氨酸蛋白酶、NTPase、RNA解螺旋酶活性功能区长度为2 000 bp的片段,将其克隆到pET-32a中,构建了原核表达载体pET-NS3,并将其在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行了表达,同时对表达产物进行了SDS-PAGE和Western blotting检测。结果表明,IPTG诱导表达得到的pET-NS3融合蛋白的相对分子质量约为97 ku,与预期结果一致,且该重组蛋白能被CSFV阳性血清所识别。     

平顶山市山丘区小流域沟道治理工程设计技术研究

平顶山市利用沟道治理工程技术试验研究成果 ,取得了较好的效果 ,为同类地区小流域沟道治理提供了可借鉴的经验。提出了干砌石坝、微型土坝、蓄水塘坝等治沟工程设计方法。     

云南苹果产区蓟马种类调查

试验对云南昭通、泸西、马龙与丽江等几个苹果主产区苹果园蓟马种群进行调查,根据蓟马的形态学进行分类和鉴定。结果显示,云南苹果产区主要存在西花蓟马(Frankliniella occidentalis)、黄蓟马(Thrips flavus)、花蓟马(F.intonsa)、烟蓟马(T.tabaci)、暗足蓟马(T.obscuripes)与八节黄蓟马(T.flavidulus)共6种蓟马。在昭通、丽江宁蒗、泸西各地,蓟马种类各不相同,其中,西花蓟马是最主要的种类,地区与品种分布最广泛,而八节黄蓟马、暗足蓟马与烟蓟马在云南少数地区少数苹果品种上分布。     

猪圆环病毒2型体外滚环复制方法的建立

通过建立猪圆环病毒2型(PCV-2)体外滚环复制(RCA)方法,为PCV-2体外检测探寻更为简便易行的路径。先将西北农林科技大学预防实验室保存分离纯化的PCV-2病料以传统PCR方法扩增出全基因组片段,然后在没有PCR扩增仪的情况下,只用简单的恒温装置,摸索RCA扩增条件,建立体外扩增PCV-2全基因组的方法。最后将2种方法扩增的全基因组片段进行测序,对其相似性进行比对。结果表明,以传统的PCR方法和RCA方法均扩增出1 767bp大小的片段,测序发现两者相似度达到99.9%。可见,成功建立了PCV-2体外滚环复制方法,扩增出病毒的全基因组片段。     

四川省部分地区大肠杆菌的耐药性监测

采用常规方法对87份采集于四川省部分地区规模化养猪场病料样品(51份),健康鸡(28份)和野生白鹭(8份)粪便样品进行大肠杆菌分离鉴定,并采用K irby-Bauer法对大肠杆菌分离株的26种抗菌药物耐药性进行检测。结果表明,分离鉴定的51株猪源大肠杆菌、28株鸡源大肠杆菌和8株白鹭源大肠杆菌均存在不同程度多重耐药性,3重及3重以上耐药菌株占总菌株数88.51%:其中对青霉素G(100%)、强力霉素(89.66%)、复方阿莫西林(85.20%)、四环素(82.76%)、头孢氨苄(63.22%)、头孢噻吩(52.87%),氨苄青霉素和复方新诺明(51.72%)的耐药性较强;8株野生白鹭大肠杆菌多重耐药性远低于猪源和鸡源大肠杆菌分离株多重耐药性,对受试喹诺酮类、复方新诺明等多种药物高度敏感。     

朱砂七提取物体外抑菌和抗病毒活性部位筛选

为筛选朱砂七提取物体外抑制9株临床分离致病菌和抑制新城疫病毒(NDV)的活性部位,采用琼脂扩散和试管稀释法进行体外抑菌试验,MTT法和鸡胚法测定了朱砂七提取物对NDV在鸡胚成纤维细胞(CEF)和鸡胚内增殖的影响.结果显示,朱砂七乙酸乙酯部位(PCE)对9株临床分离菌的MBC均小于100 g/L;朱砂七氯仿部位(PCC)有一定的抑菌作用;大黄素对沙门菌(鸡)、链球菌(猪)、无乳链球菌(奶牛)、表皮葡萄球菌(奶牛)和金黄色葡萄球菌(奶牛)的MBC分别为5,2.5,2.5,2.5,1.25 g/L;PCE进一步分离部位PCEA对沙门菌(鸡)、链球菌(猪)、无乳链球菌(奶牛)、表皮葡萄球菌(奶牛)和金黄色葡萄球菌的MBC分别为24,24,12,6,6 g/L.PCC和大黄素对NDV在CEF上增殖的抑制作用不明显;PCE对NDV在CEF上的抑制率为39.12%(P＜0.01),PCEA对NDV在CEF上的抑制率为72.33%(P＜0.01);PCEA对NDV在鸡胚中增殖具有抑制作用,其预防组和药毒混合组与病毒对照组的血凝效价差异显著(P＜0.05),而治疗组与病毒对照组差异不显著.由此可知,朱砂七提取物具有抑制细菌作用,PCE和PCEA对NDV的增殖具有一定的抑制作用.     

天津地区部分猪源大肠杆菌的OMP型

从天津各区主要养猪场分离的16株(7种血清型O20、O21、O139、O141、O93、O108、O147)大肠杆菌中提取外膜蛋白(OMP),经SDS-PAGE分析表明,5株O21菌株有2个OMP型(OMP-1和OMP-3型).3株O1s9菌株和3株O20菌株各出现2个OMP型(OMP-1和OMP-2型).2株O141菌株共出现2个OMP型(OMP-2和OMP-3).1株O93菌株、1株O108菌株和1株O147菌株均为OMP-1型.结果表明,相同血清型的菌株可以有不同的OMP型,不同血清型的菌株可以有相同的OMP型.