刚地弓形虫GRA3基因的克隆与表达

采用PCR方法扩增弓形虫GRA3基因,将扩增产物与pMD18-T Simple载体连接,重组质粒经PCR、双酶切鉴定后测序;构建pGEX-4T-1／GRA3表达载体,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、Western blot分析。结果显示,克隆的GRA3基因片段长687bp,含有1个669bp的开放阅读框,编码222个氨基酸,与GenBank中UK株（AF414079）的同源性为99．8％;表达的融合蛋白为50Ku,能被弓形虫阳性血清识别;表明该融合蛋白具有较好的免疫反应活性。     

犬附红细胞体病的感染情况调查及临床观察

采用鲜血压滴标本法结合末梢血液涂片染色法 ,调查了 80条犬感染附红细胞体的结果 ,犬附红细胞体阳性率为 91 2 5 % ;其中具有明显临床表现的犬占 1 0 % ,多数为隐性感染。对其中 1 0条阳性犬进行部分血液生理指标测定及临床症状观察 ,感染附红细胞体的犬均表现出不同程度的红细胞压积、血红蛋白、红细胞总数下降 ;嗜酸性白细胞 ,淋巴细胞略低于正常值 ;白细胞总数升高 ;嗜中性白细胞、单核细胞有所升高。此外 ,感染犬体温持续偏高 ,食欲略有下降 ,贫血、黄疸症状较轻。未见腹泻、呕吐等明显临床表现。     

不同佐剂对猪附红细胞体亚单位疫苗免疫效果的影响

为比较不同佐剂的猪附红细胞体亚单位疫苗的免疫效果,笔者通过试验提取猪附红细胞体抗原,并将其分别与白油佐剂、弗氏佐剂、明矾佐剂及铝胶佐剂混合,免疫小鼠。应用间接ELISA方法比较不同佐剂的猪附红细胞体亚单位疫苗的免疫效果。结果表明：白油佐剂组免疫效果最好,抗体水平在一周后有明显上升,其次为与弗氏佐剂组、铝胶佐剂组和明矾佐剂组。该试验为猪附红细胞体亚单位疫苗的研究提供了可靠的理论依据,为该病的防治奠定了一定的基础。     

牛源犬新孢子虫NcSRS9基因的生物信息学分析及原核表达

为了解新孢子虫NcSRS9基因的生物信息学特性,本试验对牛源犬新孢子虫吉林株NcSRS9基因进行分子克隆,利用生物信息学软件对该基因进行编码蛋白等电点、信号肽、跨膜区、糖基化位点及疏水性分析,并将该基因片段亚克隆至原核表达载体pET-28α,构建了重组表达质粒pET-28α-NcSRS9,转化至大肠杆菌BL21中并诱导表达。结果显示,克隆的NcSRS9基因片段长969bp,与GenBank（EF440644.1）上发表的基因序列同源性100%。NcSRS9基因编码蛋白等电点为5.12,在其N末端存在一个跨膜区。SDS-PAGE和Western-blotting分析显示,NcSRS9基因在大肠杆菌内得到高效表达,表达的NcSRS9重组蛋白相对分子质量约为43 000（His约为7 000,NcSRS9约为36 000）,可被牛抗新孢子虫阳性血清识别,说明表达的蛋白具有一定的反应原性。     

牛源犬新孢子虫NcGRA7基因的克隆及原核表达分析

为了解牛源犬新孢子虫NcGRA7基因的生物学特性,本实验采用PCR技术扩增牛源犬新孢子虫NcGRA7基因,并连接至pMD-18T载体中,构建重组质粒pMD 18-NcGRA7,经PCR、酶切鉴定及测序分析,将NcGRA7基因连接到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-NcGRA7,转化大肠杆菌BL21,筛选阳性克隆,将PCR和酶切鉴定正确的重组质粒进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE和westem blot分析表达产物.结果表明,扩增的NcGRA7基因片段大小为701 bp,编码233个氨基酸,与GenBank中登录的NcGRA7(AF176649)核苷酸序列同源性为98.7％;western blot分析表达蛋白的分子量为52 ku,具有较好的反应原性.本实验为犬新孢子虫NcGRA7基因疫苗研究奠定了基础.     

犬新孢子虫可溶性抗原分析及间接ELISA检测方法的建立

新孢子虫病(Neosporiasis)是由犬新孢子虫(Neospra caninum)寄生于犬、牛、羊等多种哺乳动物细胞内而引起的一种原虫病[1-2].该病主要引起母畜的流产、死胎或新生胎儿的运动障碍和神经系统症状等,对牛的危害尤为严重,可垂直传播,带虫母牛可将虫体直接传给新生犊牛,已证实该病是造成养牛业严重经济损失的一个重要原因[1-3].     

日本脑炎病毒NSl基因在大肠杆菌中的高效表达

提取日本脑炎病毒弱毒株SA14-14-2的基因组RNA，用RT-PCR扩增其NS1基因cDNA，将其克隆到原核表达载体pET-30b( )中，转化大肠杆菌BL-21（DE3）,经IPTG诱导，NS1基因获得高效表达。SDS-PAGE分析显示，表达的融合蛋白表观相对分子质量约为46000，重组NS1蛋白占菌体总蛋白的30.8%。Western blotting分析表明，重组蛋白具有良好的免疫原性。     

牛隐孢子虫卵囊分离和纯化方法的比较试验

运用3种粪便漂浮法、3种染色法和2种分离提纯法对10头犊牛的粪便进行卵囊检查、分离纯化，对这些方法进行比较。试验结果显示：饱和硫酸锌漂浮法结合姬姆萨氏染色法检查隐孢子虫卵囊，检出率最高、效果最佳；蔗糖密度梯度离心法分离纯化隐孢子虫卵囊。收集的卵囊最多，效果最好。     

PRRSVGP5蛋白原核表达载体的构建与鉴定

通过RT-PCR获得猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）CH-1a株GP5蛋白基因,克隆至pMDl8一T载体。经测序鉴定正确后,将该片段作为目的基因亚克隆至原核表达质粒pGEX-6p—1,构建原核重组质粒（pGEx—GPS）,转化至E．coli B1221感受态细胞,经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳显示重组蛋白以包涵体形式得到了表达,Westernblot与间接ELISA试验分析表明,该蛋白与PRRSV阳性血清具有良好的免疫反应性。     

牛瑟氏泰勒虫P33表面蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

应用PCR方法扩增了牛瑟氏泰勒虫吉林株P33表面蛋白基因片段,并将扩增产物与pMD18-T载体连接,重组质粒经PCR、双酶切鉴定后测序;构建P33重组pGEX-4T-3表达载体,转化大肠杆菌BL-21,经IPTG诱导表达后.进行SDS-PAGE、免疫印记分析.结果显示,获得P33基因完整开放阅读框长868 bp,编码292个氨基酸,与中国株同源性为99.1%;表达的融合蛋白相对分子质量为59 000,能被牛瑟氏泰勒虫阳性血清识别,表明该融合蛋白具有较好的免疫原性.