胰蛋白酶浓度对H9亚型禽流感病毒在MDCK细胞上增殖的影响

[目的]探讨不同胰蛋白酶浓度对低致病力禽流感病毒在MDCK细胞上增殖后的HA滴度。[方法]通过3株禽流感H9亚型病毒分别接种MDCK细胞单层,加入含有不同胰蛋白酶浓度的DMEM维持液,每隔24 h观察细胞病变,并测定上清液中的HA滴度。[结果]当维持液中胰蛋白酶含量为10～20μg/ml时,培养液上清液中的HA滴度最高,达到7 log2（1∶128）。当病毒的接种浓度为10-3和10-4时,MDCK细胞在96 h几乎全部病变,峰值出现在接种后的72～96 h。[结论]当维持液中胰蛋白酶含量为10～20μg/ml时,有利于H9亚型AIV病毒在MDCK细胞上增殖。     

鸡新城疫病毒La Sota株F基因克隆及原核表达

参照NDVLa Sota株核酸序列(AF077761)设计1对引物,利用RT-PCR扩增F基因并得到了长为1 700 bp的片段,将其克隆到pGEM-T easy vector中,经酶切鉴定和测序后克隆进原核表达载体pET-32a,将重组表达质粒转化BL21(DE3),在IPTG诱导下表达约83 kd的融合蛋白,SDS-PAGE电泳和Western blotting检测证实该基因片段获得高效表达且表达产物具有免疫学活性。     

禽用疫苗病毒浓缩技术的研究

采用FILTRON中型盒式超滤系统,分别选用截留分子量为30,50,100及300 K 4种不同孔径的超滤膜,对NDV,AIV,EDS76V,IBV及IBDV共5种病毒抗原液进行了浓缩试验研究。结果显示,这4种孔径的超滤膜均可用于上述5种病毒液的浓缩,其病毒的截留率可达99.9%~100%;采用各种病毒浓缩液、未浓缩病毒液及超滤液制成各种相应浓缩苗、未浓缩苗及超滤液乳剂免疫试验鸡。试验证明,浓缩苗明显优于未浓缩苗,在病毒浓缩过程中均未出现有效抗原成分的丢失,其抗原性也未发生变化。     

悬浮MDCK细胞源与鸡胚源H9亚型禽流感疫苗免疫效力比较研究

为探讨MDCK纯悬浮细胞制备的H9亚型禽流感灭活疫苗的免疫效果,使用10日龄SPF鸡胚和MDCK纯悬浮细胞分别接种H9亚型禽流感 BX13株病毒,收获抗原液,制备2种单价油佐剂灭活疫苗,按照不同免疫剂量对21日龄SPF鸡进行免疫接种,测定免疫后不同时间的血清HI抗体,免疫后21 d翅静脉攻毒,测定疫苗的保护率。结果表明：2种疫苗分别以0.3、0.2、0.1、0.02 mL/只的剂量接种21日龄SPF鸡后,7 d HI抗体均为0log2,免后14 d、21 d时2种疫苗相同免疫剂量组间HI抗体无明显规律性差异。免疫后21 d,2种疫苗0.1mL/只～0.3mL/只的免疫剂量,各组间HI抗体水平无明显差异,可以达到1∶128以上。攻毒试验表明,鸡胚源疫苗0.1 mL/只、MDCK细胞源疫苗0.2mL/只的免疫剂量可以达到10/10保护。本研究为使用MDCK纯悬浮细胞制备的H9亚型禽流感疫苗的深化研究和应用奠定了基础。     

一株H9N2亚型禽流感病毒鸡胚培养工艺研究

为了探讨H9N2亚型禽流感病毒在鸡胚上最佳培养工艺,试验采用H9N2亚型禽流感病毒分离株以不同稀释倍数接种不同鸡胚(SPF及普通鸡胚)、不同日龄鸡胚及不同培养时间收获鸡胚尿囊液,比较不同培养条件下制备出的鸡胚尿囊液的产量及病毒效价。结果表明:H9N2亚型禽流感病毒接种无禽流感病毒(H9亚型)HI母源抗体鸡胚的最佳病毒稀释倍数为1×10~(4 )～1×10~5倍,接种带有禽流感病毒(H9亚型)HI母源抗体鸡胚的最佳病毒稀释倍数为1×10~3～1×10~4倍,最佳接种日龄为10日龄,最佳培养时间为96～120 h。说明采用优化的鸡胚培养方法生产H9N2亚型禽流感病毒可以得到高质量、高产量的病毒液。     

鸡新城疫-传染性法氏囊病-禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗对雏鸡的免疫效力研究

为了评估鸡新城疫(ND)-传染性法氏囊病(IBD)-禽流感(AI)(H9亚型)三联灭活疫苗对雏鸡的免疫效力,采用该疫苗分别免疫1、7、10、14、21日龄SPF雏鸡和带有母源抗体的普通雏鸡,免疫后21d~28d采血测定ND血凝抑制抗体(HIAb)、IBD中和抗体(NA)及AI(H9)HIAb抗体,并用传染性法氏囊病病毒(IBDV)强毒攻击。结果显示,免疫后各不同日龄免疫组SPF雏鸡的ND HIAb、IBD NA及AI(H9)HIAb滴度分别为7.9log2~8.3log2、13.9log2~15.8log2及8.0log2~8.9log2,IBDV攻毒均100%保护;而普通雏鸡免疫后的ND HIAb、IBD NA及AI(H9)HIAb滴度,1日龄免疫组分别为5.9log2、12.1log2和5.6log2,7、10、14、21日龄免疫组分别为6.1log2~7.0log2、12.6log2~14.5log2和6.0log2~7.5log2;IBDV攻毒,1日龄免疫组普通雏鸡保护率为60%,7、14及21日龄免疫组保护率均为100%;结果证实,SPF雏鸡所产生的免疫效力要高于带有母源抗体的普通雏鸡,1日龄普通雏鸡免疫所产生的免疫效力明显低于其他日龄。根据试验结果,推荐该疫苗对雏鸡的使用日龄为7日龄~14日龄。     

MDCK细胞悬浮驯化及对H9亚型禽流感病毒敏感性的研究

为获得对H9亚型禽流感病毒敏感的纯悬浮MDCK细胞株,通过逐渐降低血清的方法对贴壁依赖的MDCK细胞进行了无血清纯悬浮驯化,最终获得了一株对H9亚型禽流感病毒敏感的纯悬浮细胞株MDCK-sus。通过测定表明,该细胞株能够迅速增殖,倍增时间为24h,使用H9亚型禽流感病毒BX13株感染该细胞,培养72h,培养液的病毒HA价可达到1∶512,每0.1mL病毒含量达到108.5EID50,为利用生物反应器大规模悬浮培养制备H9亚型禽流感病毒抗原奠定了基础。     

鸡传染性腺胃炎病原分离及鉴定

１９９８ 年６ 月～７ 月，河北省玉田县某个体户蛋种鸡场孵化出的海赛商品蛋鸡连续７ 批共６ 万余羽，在３０～８０ 日龄时发生一种以极度消瘦、腺胃肿大为特征的疾病。采集发病鸡的腺胃制成匀浆乳剂，接种 Ｓ Ｐ Ｆ鸡胚，可引起典型的鸡胚矮小。卷曲、僵化、中肾尿酸盐沉积等鸡胚病变。电镜观察鸡胚分离物可见大量冠状病毒粒子；分离物能与标准 Ｉ Ｂ Ｖ 阳性血清（ Ｍ４１ 株抗血清）中和呈现阳性反应；分离物经浓缩后用魏氏梭菌滤液处理，可呈现血凝活性；分离物对氯仿敏感；实验结果表明，分离物为传染性支气管炎病毒。将发病鸡的腺胃匀浆乳剂及第５ 代分离物（腺胃匀浆乳剂在鸡胚中盲传５ 代的培养物），接种１ 日龄及７日龄 Ｓ Ｐ Ｆ鸡，结果用鸡腺胃匀浆乳剂接种 的鸡出现了极度消瘦、腺胃肿大等与自然病鸡相同的临床症状及剖检变化，而用第５代分离物接种鸡后，鸡只正常生长发育，未出现任何症状。分别取２ 个组鸡的血清进行１７ 种相关病原检测，结果接种腺胃匀浆乳剂的鸡只检出了网状内皮组织增生病病毒（ Ｒ Ｅ Ｖ） 抗体， 表明腺胃内可能存在 Ｒ Ｅ Ｖ；另外，２ 个组的鸡 Ｉ Ｂ Ｖ 抗体均为阳性，除此之外其他病原抗体监测结果均为阴性。初步的试验结果证实，我们从发病鸡腺胃内分离的     

鸡新城疫病毒强毒株的分离与鉴定

从河北、天津、北京等省市发病鸡群中分离到8株有血凝性的分离物,其血凝作用可被新城疫阳性血清所抑制,而不能被AIV(H9亚型)、EDS76阳性血清所抑制,表明8株分离物均为新城疫病毒。利用鸡胚终点稀释法对这8株NDV进行了克隆。对8株NDV的毒力指数(MDT、ICPI、IVPI)测定结果显示:MDT在42 9～49 5h之间,ICPI在1 95～2 00之间,IVPI在2 68～2 89之间。表明8株NDV均为新城疫病毒强毒株,其毒力与标准强毒株F48E8相近。各分离毒株经2%磷钨酸负染后,电镜下观察,可见丝状、圆形或不规则形态的病毒粒子,表面有纤突样结构。各毒株的大小不尽相同,粒子直径或长轴在100～500nm之间。