PRRSV HeN-3弱毒株不同途径感染仔猪诱导天然免疫因子差异性比较

为了比较猪繁殖与呼吸综合症病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV) HeN-3弱毒株经滴鼻和注射两种途径感染仔猪后诱导天然免疫因子产生的差异,经滴鼻和注射两种途径感染仔猪后,前腔静脉采集凝血与抗凝血,通过ELISA Kit检测血清中IFN...     

鸡新城疫病毒V4株口服免疫效果

鸡新城疫病毒Ｖ４株口服免疫效果夏平安侯安祖＊李宏基＊＊（郑州牧业工程高等专科学校微生物学教研室，郑州４５００４５）对鸡新城疫病毒Ｖ４（ＮＤＶ４）株的安全性及饮水、滴鼻免疫研究发现［１］，该株是良好疫苗株，故有必要对其口服免疫效果做进一步研究。１材料与...     

应用间接免疫荧光法检测狂犬病病毒

取０．５ｍｌ兔ＢＨＫ－２１新鲜健康细胞液和０．１ｍｌ狂犬病病毒细胞液在含小飞片青瓶中混合，培养２４小时后制片，加抗狂犬病病毒兔抗体感作，用驴抗兔荧光抗体染色，通过荧光显微镜观察细胞浆内黄绿色结构判定病毒是否在细胞内增殖，从而建立了检测狂犬病病毒的间接免疫荧光法（ＲＦＡＴ）。用ＲＦＡＴ检测５批Ｆｌｕｎｇ－ＬＥＰ株培养液，５批ＥＲＡ株培养液和５批鹿毒８２０２株培养液，ＴＣＩＤ５０平均滴度分别为５．６８、６６０５、４．８６；对小鼠脑内接种，ＭＬＤ５０平均滴度分别为５．５、５．５６、４．２５。从试验结果看，ＲＦＡＴ是取代ＭＬＤ５０测定法的理想方法。     

PRRSV Hn-1/06株GP5蛋白基因表达载体的构建及高效表达

通过对PRRSV Hn-1/06株ORF5基因序列分析,设计删除信号肽和跨膜功能区的ORF5序列的3对引物,应用重叠延伸PCR以PTG19-T-ORF5质粒为模板进行扩增目的片段,得到长度为410 bp的片段。然后将此基因亚克隆到原核表达载体PET32a,经筛选获得了阳性重组质粒PET32a-ORF5abc,进而在IPTG的诱导下成功表达,获得了大小约为34 kD的融合蛋白GP5abc-His,Western blotting检测结果证实表达的融合蛋白具有良好的生物学活性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒Hn-1/06株GP2蛋白的原核表达

根据GenBank中PRRSV美洲株ATCC VR2332的ORF2基因序列,利用Primer5.0软件设计合成了一对特异性引物,经RT-PCR从河南分离株Hn-1/06株扩增得到了大小为771 bp的片段,并将扩增的片段插入pTG19-T载体进行测序而获得含有ORF2的阳性克隆pTG19-T-GP2。将此基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1,经筛选获得了阳性重组质粒pGEX-GP2,进而在IPTG的诱导下成功表达,获得了大小约为45 kD的融合蛋白,纯化后经Western blot检测证实表达的融合蛋白具有良好的生物学活性。     

猪肺巨噬细胞FcγR Ⅲ受体基因的克隆与序列分析

为研究猪肺巨噬细胞FcγR Ⅲ的生物学功能,本研究应用RT-PCR技术从猪肺巨噬细胞总RNA中克隆出猪FcγR Ⅲ的cDNA序列,并对其进行了分析。结果表明,克隆到的序列长820 bp,包含有1个771 bp完整开放阅读框(ORF),与GenBank中登录的猪FcγR Ⅲ序列(AF237453)的核苷酸同源性为99.9％;与人、牛、马、绵羊、猕猴、狗、猫、小鼠氨基酸同源性分别为61.6%、62.9%、55.3%、62.2%、63.0%、59.0%、61.8%和53.2%;蛋白质分子结构预测结果表明,该分子由信号肽（20个氨基酸）、胞外区(185个氨基酸)、跨膜区(23个氨基酸)和胞内区(28个氨基酸)组成,在胞外区存在2个Ig样结构域。猪肺巨噬细胞FcγR Ⅲ基因的成功克隆,为进一步研究其结构与功能奠定基础。     

人胰岛素基因在家蝇幼虫中的表达

构建了家蝇基因组文库,通过噬菌斑原位杂交技术从家蝇基因组文库中筛选出mdYP1克隆,并从mdYP1克隆中分离到含约1.7 kb 5’-上游区的家蝇卵黄蛋白-1基因组基因序列.PCR扩增出大小不同的4个启动子片段,分别插入到切除了CMV启动子的pCMV-GFP质粒中的绿色荧光蛋白报告基因上游,构建pMYP1-GFP,pMYP2-GFP,pMYP3-GFP和pMYP4-GFP 4个重组质粒,经电转移试验和荧光检测表明,P2( 684/ 7),P3( 1165/ 7)和P4( 1616/ 7)3个启动子片段具有转录活性.将P2,P3分别插入到切除了CMV启动子的pCMV-ImINS重组质粒中的人胰岛素基因上游,构建pMYP2-ImINS和pMYP3-ImINS重组质粒,电转移新鲜家蝇卵,放射免疫分析法检测人胰岛素在蝇蛆中的表达水平.pMYP2-ImINS和pMYP3-ImINS组的人胰岛素表达量分别为29.6,22.1mU.L-1;阳性对照组为13.2 mU.L-1;阴性对照组为8.8 mU.L-1.结果说明P2启动子片段活性最强,同时又证明了内源性启动子能提高外源基因的表达效率.     

河南省猪场戊型肝炎病毒流行病学调查

为了解河南地区猪戊型肝炎感染情况,同时掌握该地区猪感染戊型肝炎病毒的基因型,对来自河南新乡、平顶山、南阳等地区不同商品猪场血清、肝脏、粪样品,采用ELISA技术检测猪血清中抗HEV特异性抗体水平,并使用套式RT-PCR检测肝脏和粪便中猪戊型肝炎病毒核酸。结果显示530份样品中HEV抗体阳性率0.6%,HEV RNA均为阴性,推测目前河南省猪戊型肝炎病毒感染率较低。     

PRRSV Hr-1/06株GP5蛋白基因的克隆及表达载体的构建

[目的]克隆PRRSV Hn-1/06株GP5蛋白基因并构建其原核表达载体.[方法]根据PRRSV美洲株ATCC-VR2332的ORF5基因序列设计特异性引物,用RT-PCR方法从Hn-1/06株中扩增得到GP5蛋白基因的片段,与PTG19-T载体连接获得其阳性克隆PTG19-T-ORF5.以该基因片段为模板分别设计ORF5完整序列和删除信号肽的ORF5序列两条引物,进行PCR扩增,将目的片段与原核表达载体pET32a连接,并对其进行酶切鉴定.[结果]扩增得到GP5蛋白基因全长序列603 bp,编码200个氨基酸残基;具有3个潜在的N-糖基化位点和9个半胱氨酸;分子量为22.4 kD,等电点为8.550;双酶切pET32a-ORF5鉴定.结果与预期一致,证实重组质粒构建成功.[结论]成功构建了PRRSV Hn-1/06株GP5蛋白基因的表达载体,为深入研究GP5蛋白的本质与功能及其致病性奠定基础.     

感染PRRSV Nsp2基因部分缺失变异株的仔猪抗体变化规律

为了解PRRSV Nsp2基因缺失变异株的致病性,采用2个Nsp2基因分别连续缺失3个和89个碱基的PRRSV变异株Hn-2(GenBank:FJ237419)和Hn-4(GenBank:FJ237421)的病毒液,人工滴鼻感染断奶仔猪,同时用Marc-145健康仔猪细胞培养液滴鼻作对照,在感染后0,7,14,24,3...