草鱼柠檬酸合酶基因SNP筛选及与生长性状的关联分析

根据草鱼(Ctenopharyngodon idella)EST-SNP库中预测的柠檬酸合酶基因的1个Contig序列,设计引物扩增该基因的部分序列,然后采用PCR产物直接测序法筛选SNP突变点。测序的序列经比对后,共筛选到2个在内含子10上的SNP突变点:A-386G和C-499G。随机选择同批繁殖和同塘混养的144尾草鱼对2个SNP位点用Snapshot方法进行检测和分型,并统计基因型频率。A-386G位点的AA基因型占47.10%,AG基因型占38.41%、GG基因型占14.49%;C-499G位点的CC基因型占31.85%,CG基因型占46.67%,GG基因型占21.48%,均属于中度多态位点。利用一般线性模型(GLM)分析2个SNP位点与草鱼6个生长性状(体质量、体长、体高、头长、尾柄长和尾柄高)的相关性,结果显示,A-386G和C-499G位点的不同基因型在这6个生长性状均值有差异,但均不存在显著差异。将这2个SNP不同基因型两两组合,一共组成7种双倍型(去掉频率小于3%的组合D2和D5),GLM相关分析表明5种双倍型在5个生长性状(体质量、体长、体高、尾柄长和尾柄高)上均存在差异,其中在头长上存在显著差异,D6双倍型(A-386G/AG和C-499G/GG)在6个生长性状上均值均最大,属于生长优势双倍型。本研究显示,筛选到的柠檬酸合酶基因上的2个SNP位点具有用于草鱼生长性状的分子辅助育种的潜力。     

草鱼体脂性状的变异特征及相关性

为精确且批量测定草鱼肠系膜脂肪（肠脂）沉积量,避免传统人工刮取称量方法耗时费力、量化粗糙等问题,实验利用脂溶性染料油红O可特异性着色脂肪的特性,探索开发出一种便捷定量草鱼肠脂含量的新方法。结果发现,麻醉解剖200尾平均体重约80 g的草鱼,取出整个内脏团简单处理并塞入PIT个体识别标记后,样品集中进行多聚甲醛固定、无水乙醇脱水、油红O染液定染,可在维持样品组织完整的基础上,实现肠脂组织的特异性、均一化批量染色处理。各染色样品再分别通过无水乙醇溶剂完全萃取,萃取液吸光度测定,并依据绘制的标准曲线（y = 0.0276x + 0.0403, R² = 0.9997）,即可精确获得个体肠脂沉积的相对含量,是以萃取出的油红O质量来表示。对比发现,样品肠脂组织染色-萃取量化结果与传统刮取称量数据保持了较高的相关性（n = 20,r = 0.80）。进一步的统计分析显示,对于同塘养殖体重变异系数8.93%的草鱼群体（n = 200）,萃取测定的肠脂沉积量变异系数达到24.49%,预示该性状具有丰富变异特征及遗传改良潜力。相关与聚类分析显示,肠脂沉积量与内脏质量相关性最高（r = 0.60）,并且聚为一类,符合二者同属脏器关联指标的预期。多元线性回归分析显示,利用简单易测的形态指标只能解释肠脂沉积量的少量变异（R² = 0.20）,表明基于表型性状的拟合回归方程进行间接预测的效果不佳,直接测定是该性状精准量化的有效途径。本研究为草鱼体脂性状改良提供了一种性状精确测定方法。

     

草鱼的微卫星亲权鉴定

【目的】从亲权排除率、鉴别准确率、鉴别成功率等方面评价微卫星标记鉴别草鱼亲权关系的可行性,为草鱼系谱信息的确定奠定基础。【方法】利用8个微卫星标记检测5个草鱼家系亲本（F0）及其子代（F1）的基因型,以Cervus3．0软件进行亲权鉴定,并统计微卫星位点的等位基因数（Na）、多态信息含量（PIC）、观测杂合度（H0）和期望杂合度（He）等;最后通过模拟分析和试验验证,评估8个微卫星位点最多可鉴定的亲本数及其与鉴定率、置信度之间的关系。【结果】8个微卫星位点中,当两个亲本基因型未知时,单个亲本排除率（E-1P）介于0．342-0．668,平均值为0．520;当一个亲本基因型已知时,另一个亲本的排除率（E-2P）介于0．521-0．802,平均值为0．681;一对亲本组合的亲权排除率（E-PP）介于0．711-0．937,平均值为0．847。以95％置信水平和100％鉴定率为标准,模拟分析及试验验证结果表明,所选择的8个微卫星位点最多可以鉴定598个已知性别的亲本或431个未知性别的亲本。【结论】所选的H118、H137、H165、H148、4703、C2489、H57、H81等8对微卫星标记可在生产及科研试验中用于获取草鱼系谱信息。     

盐碱胁迫对莫桑比克罗非鱼TauT2基因表达的影响

【目的】研究在莫桑比克罗非鱼（Oreochromis mossambicus）中新发现的编码牛磺酸转运蛋白的基因TauT2在盐碱胁迫下对鱼体渗透压调控的作用,为深入阐明鱼类中牛磺酸转运蛋白的功能提供更全面可靠的数据。【方法】通过PCR和直接测序的方法对TauT2基因的编码区序列（CDS）进行分析,用生物信息学分析方法预测其编码蛋白的氨基酸序列及其高级结构,并利用荧光定量PCR检测该基因在肝、肠、肌肉等13个组织中的表达特征,以及在盐碱胁迫（盐25 g/L,碱4 g/L） 96 h内,不同时间点鳃、肾、肠和肝组织中TTauT2基因mRNA的表达水平。【结果】获得的TauT2基因CDS序列全长1881 bp,共编码626个氨基酸,氨基酸序列与斑马拟丽鱼（Maylandia zebra）牛磺酸转运蛋白的一致性最高,为98.72%,与已报道的莫桑比克罗非鱼的tTAUT1蛋白一致性为88.52%,该蛋白具有典型的牛磺酸转运蛋白跨膜结构域。荧光定量PCR结果表明,TauT2基因在肝、肠、肌肉等13个组织均有表达,其中血液中表达量最高,肠中的表达量最低。盐碱胁迫条件下,TauT2基因mRNA表达水平在鳃、肾、肠和肝组织中的表达均呈先升高再下降的变化趋势,鳃和肝达峰值的时间为48 h,肾和肠达峰值的时间分别是24和72 h,达峰值的时间与莫桑比克罗非鱼的tTauT1基因存在明显差异。【结论】莫桑比克罗非鱼在受到盐碱胁迫后,通过提升TauT2基因的表达量来有效调控体内渗透压,为渗透压稳态的维持发挥作用。莫桑比克罗非鱼体内至少有2种不同的牛磺酸转运蛋白,已发现的这2个蛋白氨基酸序列、三级结构及在鱼体不同组织中精细调节体内渗透压的功能存在一定差异。     

草鱼MyoD基因SNP和Indel标记的筛选及其与生长性状的关联分析

为探索MyoD基因多态性对草鱼(Ctenopharyngodon idella)生长性状的影响,采用PCR产物直接测序的方法,检测草鱼MyoD基因上的突变位点,并分析其与草鱼生长性状的相关性。结果表明:在草鱼MyoD基因上筛选到4个多态性高、分型稳定的突变位点,即M1(940后T碱基的插入)、M3(1630后重复单元AATAGCCT的缺失)、M4(G1669A)和M5(A1681T)。M1位点不同基因型个体间的体长、全长、尾柄长和尾柄高存在显著差异(P0.05),纯合缺失基因型(DD)显著大于纯合插入基因型(TT);M3和M4位点不同基因型个体间的生长性状差异均不显著(P0.05);M5位点不同基因型个体间的体质量、体宽、体高和眼间距存在显著差异(P0.05),优势基因型为TT。MyoD基因的M1和M5突变位点可作为草鱼选育的候选分子标记。     

3个尖塘鳢引进群体繁育后代的遗传多样性分析

【目的】分析3个尖塘鳢引进群体繁育后代的遗传多样性和遗传结构,为尖塘鳢亲本管理和资源可持续利用提供基础资料,同时为尖塘鳢的遗传改良及新品种培育打下基础。【方法】采用微卫星分子标记分析2000年引进的线纹尖塘鳢群体繁育后代（AZ1）、2005年引进的线纹尖塘鳢群体繁育后代（AZ2）及1986年引进的云斑尖塘鳢群体繁育后代（TG）的遗传多样性,运用PopGene32、CERVUS 3.0、Arlequin 3.1计算3个尖塘鳢群体的等位基因数（Na）、期望杂合度（He）、多态信息含量（PIC）及遗传分化系数（F_st）等遗传参数,基于Nei氏遗传距离利用MEGA 7.0中的非加权组平均法（UPGMA）构建系统发育进化树,并以Structure 2.3分析群体间的遗传结构。【结果】12个微卫星分子标记在3个尖塘鳢群体中扩增得到32个等位基因。AZ1群体、AZ2群体和TG群体的平均Na分别为1.33、1.92和2.33,平均He分别为0.034、0.180和0.214,平均PIC分别为0.031、0.155和0.191。3个尖塘鳢群体间的F_st为0.077～0.384、遗传相似度为0.926～0.950、遗传距离为0.052～0.077。3个尖塘鳢群体有22.54%的变异来自于群体间,77.46%的遗传变异来自群体内。基于Nei氏遗传距离构建的UPGM系统发育进化树显示,AZ1群体和AZ2群体先聚类为一支,然后与TG群体聚类在一起。【结论】3个尖塘鳢引进群体繁殖后代遗传多样性水平较低,尤其是AZ1群体近交程度较高,因此相关引种单位或繁殖场需尽快采取相应的选育手段提高现有杂交鳢群体遗传多样性,避免近交衰退带来的风险,也可通过引进新的种质资源提高杂交鳢遗传多样性。此外,3个杂交鳢群体尚未出现种质混杂和杂交情况,仍可作为杂交鳢遗传育种奠基种群。     

二龄草鱼形态性状对体质量影响效果的分析

为研究草鱼各形态性状对体质量的影响,测定287尾二龄草鱼全长、体长、头长、体宽、体高、眼间距、肛前距共7个形态性状和体质量,采用相关分析、通径分析和多元回归分析方法对草鱼7个形态性状与体质量进行相关性分析。剔除对体质量影响不显著的头长、体高及与体长存在显著共线性的全长,建立了以体质量为依变量（Y）,体宽（X₄）,眼间距（X₆）,肛前距(X₇）,体长（X₂）为自变量的回归方程：Y=-3048.127+220.925X₄+262.367X₆+33.776X₇+10.648X₂。所选形态性状与体质量的相关指数R² =0.900,说明所选性状是影响草鱼体质量的主要形态性状,其中体宽对体质量的直接影响(P=0.430)最大,是影响体质量的最主要因素。在选育过程中,可将4个主要形态性状作为一个整体考虑,作为草鱼选育的测量指标。     

长江和珠江水系1龄草鱼生长性能分析

为评估长江水系和珠江水系草鱼Ctenopharyngodon idella群体的生长性能,在广东佛山对来自长江水系的监利、石首、宁乡草鱼群体和来自珠江水系的清远、佛山、肇庆草鱼群体的繁殖后代进行生长对比试验,从每个群体随机选择300尾样品,注射电子芯片标记后同塘养殖,并分别在4、8、12月龄时测量样品的体质量和体长性状。结果表明:4月龄时,6个群体间体质量和体长差异均不显著(P0.05),8月龄时,群体间体质量和体长差异逐渐增加;12月龄时,佛山群体平均体质量最大(671.59 g),比其他群体平均体质量大1.25%~16.79%,清远群体平均体质量最小(82.92 g),监利群体平均体长最长(31.11cm),比其他群体长4%~16%,清远群体平均体长最短(26.92 cm),显著短于其他群体(P0.05);12月龄时,珠江水系3个群体草鱼肥满度为2.55~3.30,长江水系草鱼肥满度为2.07~2.52,珠江水系草鱼群体的肥满度明显高于长江水系。本研究结果可为快速生长草鱼新品种基础种群的确定提供依据。     

软骨与正常华南鲤肌肉营养成分的比较分析

为研究华南鲤Cyprinus carpio rubrofuscus软骨化的产生原因和形成机制,并评价其肌肉营养成分,取9月龄软骨华南鲤(体质量为270.2 g±62.4 g)测定其肌肉营养组成,并与骨骼发育正常的相同规格华南鲤进行比较。结果表明:软骨华南鲤水分含量极显著低于正常华南鲤(P0.01),而粗脂肪含量却显著高于正常华南鲤(P0.05);用酸水解法从肌肉中共检测出16种氨基酸,软骨华南鲤除组氨酸(His)含量显著高于正常华南鲤(P0.05)外,两组鱼其他15种氨基酸含量均无显著性差异(P0.05);对两组华南鲤的必需氨基酸进行评分,计算得到的必需氨基酸含量均高于FAO/WHO评分模式,接近全鸡蛋白蛋白质模式,软骨和正常华南鲤的必需氨基酸指数(EAAI)分别为87.17和90.24,骨骼正常华南鲤的所有必需氨基酸评分和化学评分指标均略高于软骨鱼组,但无显著性差异(P0.05),说明软骨这一性状并未显著影响华南鲤的肌肉蛋白质品质,两组鱼氨基酸营养成分相似,均为优质的蛋白源;进一步对肌肉脂肪酸组成和含量进行测定,测得的23种脂肪酸中有9种脂肪酸含量存在显著或极显著性差异(P0.05或P0.01),其中包括4种饱和脂肪酸、3种单不饱和脂肪酸和2种多不饱和脂肪酸,说明软骨华南鲤的产生可能与机体中脂肪代谢过程的变化有关;对两组鱼肌肉中矿物质元素含量分析表明,软骨华南鲤的磷含量显著低于正常华南鲤(P0.05),而钙等其他6种元素与正常华南鲤均无显著性差异(P0.05)。研究表明,软骨华南鲤的产生可能与机体中脂肪酸代谢异常及磷缺乏相关,其具体产生机制有待进一步研究。