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提取睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)基因组DNA,PCR扩增teiR基因,将扩增产物克隆到pET28a中,经酶切验证后获得teiR基因表达载体pET28a-teiR.将重组质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21,添加终浓度为1 mmol.L-1的IPTG进行诱导,提取细菌总蛋白进行蛋白的SDS-PAGE电泳.并根据融合蛋白特性,利用Ni-NTA Spin Column对TeiR融合蛋白进行分离纯化,经分离纯化后的重组蛋白在SDS-PAGE上呈现出单一条带.进一步以获得的TeiR融合蛋白为抗原,制备兔抗TeiR多克隆抗体,经ELISA测定该抗体的效价为1∶10000,该抗体与睾丸酮丛毛单胞菌天然TeiR蛋白反应良好,说明该抗体特异性良好. 相似文献
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利用不同作物的Sgt1基因的SGS保守区域的氨基酸保守位点设计简并引物,从果蔗的cDNA中克隆分离出果蔗SoSgt1基因片段。以果蔗SoSgt1基因片段为探针,利用电子克隆和序列拼接方法并通过RT-PCR验证获得了一个全长1438bp的cDNA序列。通过ORF软件分析,预测得到的蛋白质具有362个氨基酸。利用NCBI数据库中的Protein Blast分析SoSgt1蛋白氨基酸序列,得出含有SGT1蛋白的3个典型的保守结构域(TPR,CS和SGS),与其他作物的SGT1蛋白比较具有较高的相似性。利用梢腐病病原Gibberella fujikuroi接种福安果蔗叶片,检测到SoSgt1基因的转录水平逐渐提高,并用果蔗SoSgt1基因的cDNA片段设计2个酶切位点,反向插入到植物真核表达载体pCAMBIA1301,构建反义表达载体pCAM-SGT。 相似文献
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[目的]采用高效液相色谱—电喷雾离子阱质谱技术对锦锈杜鹃叶中的黄酮类化合物进行分析和鉴定。[方法]色谱条件为:Wa-ters C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm);流动相A相为水(含浓度0.1%甲酸),流动相B相为无水甲醇;梯度洗脱程序:0~24 min,31%~42%B;24~30 min,42%~50%B;30~35 min,50%~60%B;35~40 min,60%B;进样量20μl;流速为0.7 ml/min;柱温30℃;检测波长356 nm。质谱条件为:电离源:电喷雾离子源;负离子模式扫描;干燥气温度:350℃;干燥气体积流量(N2):10 L/min;雾化气压力275.8 KPa;毛细管电压:3.5 KV,毛细管出口电压100 V;质量扫描范围:m/z 200~700。使用ESI离子源,负离子模式下采集数据。[结果]通过与文献数据和部分标准品对照,推断出锦锈杜鹃叶中含有5个黄酮类化合物,分别是金丝桃苷、异槲皮苷、广寄生苷、槲皮苷、槲皮素。[结论]液质联用技术具有快速、准确、有效的特点,是一种相对较好的定性测定方法。其对锦锈杜鹃叶中的黄酮类化合物进行分析和鉴定,为今后锦锈杜鹃的应用提供了一定的理论依据。 相似文献
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〔目的〕建立中药材建泽泻中23-乙酰泽泻醇B的提取及检测体系。〔方法〕采用石油醚超声处理,辅助旋转蒸发提取23-乙酰泽泻醇B,利用高效液相色谱法检测;色谱柱:Waters C18柱(4.6 mm×250 mm,5μm);柱温:室温;流动相:乙腈-水(80∶20);流速:0.8 mL/min,检测波长:208 nm。〔结果〕建泽泻中23-乙酰泽泻醇B在25~500μg/mL的线性关系良好;平均回收率为98.1%,RSD为3.10%。〔结论〕该方法简便、准确、重复性好,适用于微量建泽泻的检测。 相似文献
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根据已克隆的抗病基因保守结构域设计简并引物,以湖南黑豆(HH)为试材,通过RT-PCR,从cDNA中扩增抗病基因同源序列,测序鉴定出2个含有通读阅读框的DNA片段:FNBSl、FNBS3。FNBS1大小为534bp,编码178个氨基酸;FNBS3大小为513bp,编码169个氨基酸。BLASTP分析表明,2个片段均具有NB-ARC结构域(与植物抗病有关),并且包含p-loop、Kinase-2、HD等结构域。基因FNBSl与大豆基因RPMl-like编码的氨基酸序列的同源性为98%,基因FNBS3与大豆基因N-like 编码的氨基酸序列的同源性为99%,推测FNBS1、FNBS3可能是黑豆NBS-LRR类抗病基因的核心区域。 相似文献
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观赏向日葵花青素苷合成途径同源基因的克隆与表达 总被引:4,自引:1,他引:3
根据已发布基因的保守区域设计引物,从观赏向日葵(Helianthus annuus L.)舌状花中克隆到花青素苷生物合成途径中PAL、CHS、CHI、F3'H、DFR和ANS等6个结构基因的保守序列。序列分析表明6个结构基因与其它植物来源的花青素苷生物合成相关基因均具有较高的同源性,分别为95%~97%、83%~99%、64%~80%、80%~82%、64%~85%和87%~89%。系统进化分析表明6个结构基因的系统进化基本上符合植物分类学分类。半定量RT-PCR分析,表明除CHS基因在管状花中未表达外,6个基因在舌状花、管状花、花蕾、叶片、茎皮中均有表达;大部分基因在花开放初期和盛期的表达较高,而花完全开放后,所有基因的表达量降低;观赏向日葵花青素苷合成相关基因的表达量在紫红色花瓣中高于红褐色,深色花瓣高于混杂色花瓣。 相似文献
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不同-10区保守序列的tac启动子表达睾丸酮丛毛单胞菌中的活化因子 总被引:2,自引:3,他引:2
提取睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)的基因组DNA,利用PCR扩增活化因子(activator)基因.将扩增产物克隆到pKtac1(含强启动子tac)中,构建含全长activator基因(564bp)的重组质粒pKtac1-act1和含部分activator基因(409bp)的pKtac1-act2.测序结果发现重组质粒pKtac1-act2的tac启动子-10保守区由TATAAT突变为TATGTT.将pKtac1-act1和pKtac1-act2分别进行酶切和连接,获得重组质粒pKtac1-act3(含启动子-10保守区为TATAAT,409 bp的部分activator基因)和pKtac1-act4(含启动子-10保守区为TATGTT,564 bp的全长activator基因).将4个重组质粒分别转化入宿主菌Escherichia coli HB101中,用酶联免疫分析方法测定细菌总蛋白质中的activator表达量;将pAX1(含3α-hsd/CR基因)分别和4个重组质粒一起转化入宿主菌E.coliHB101中,测定细菌总蛋白质中的3α-hsd/CR和activator的表达量.结果表明:启动子-10保守区为TATAAT的质粒比-10保守区为TATGTT的质粒有更高的转录活性;过量的actvitor表达可能影响质粒pKtac1-act3表达的稳定性;启动子-10区保守序列的下降突变(pKtac1-act2,TATAAT→TATGTT)及tac启动子的丢失(pKtac1-act3,继代培养4次)揭示了宿主菌E. coli HB101的自身防护机制. 相似文献
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为进一步研究甘薯病原微生物的侵染对甘薯病程相关非表达子1基因(NPR1)表达的影响,以甘薯肌动蛋白(β-ac-tin)基因为内参照基因,提取甘薯叶片总RNA,反转录为cDNA,同批异管对该2个基因进行PCR扩增.通过对循环数的优化和对体系重复性、准确性的分析,建立了一个稳定、方便的半定量RT-PCR体系. 相似文献