基于粗提物的水稻条纹病毒体外“抓帽”体系

【背景】布尼亚病毒目(Bunyavirales)和正黏病毒科(Orthomyxoviridae)病毒从帽子结构下游10—20个碱基处切割寄主mRNA,以5′端切割产物(帽子序列)作为引物起始自身基因组的转录,生成含一段异源帽子序列的病毒mRNA,这一过程称为"抓帽"。水稻条纹病毒(rice stripe tenuivirus, RSV)是一种布尼亚病毒,其"抓帽"机制还不甚清楚。【目的】研究RSV粗提物能否从溶液中的外源mRNA"抓帽",以建立一种便捷的体外体系,用于解析RSV"抓帽"和转录机制。【方法】以PEG沉淀和超速离心法粗提RSV,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和质谱技术分析粗提物成分。然后取少量粗提液,加入富含珠蛋白(globin)mRNA的兔网织红细胞裂解液(rabbit reticulocyte lysate,RCL)和合适浓度的金属离子配制体外"抓帽"体系。待体外反应结束,提取体系中总RNA,以巢式RT-PCR扩增含珠蛋白-αmRNA帽子序列的RSV mRNA,并对其进行克隆,通过序列分析比较RSV体外"抓帽"与体内"抓帽"的异同。【结果】从100 g感染R...     

毒死蜱微球和乳油在水中的消解动态及其对白纹伊蚊幼虫的毒力

室内条件下,研究了不同浓度毒死蜱微球和毒死蜱乳油在水中的消解动态及其对白纹伊蚊Aedes albopictus 3龄幼虫的持续毒杀作用。结果表明:毒死蜱微球在水中的消解速率比乳油慢,半 衰期比乳油的长,高浓度微球和乳油的消解半衰期均长于低浓度下的消解半衰期。有效成分为1.2、 12和24 mg/L的毒死蜱微球和毒死蜱乳油在水中的消解半衰期分别为(19.4±2.1) d、(27.8±1.6) d、(31.0±1.7) d和(12.8±1.0) d、(16.1±0.9) d、(19.7±1.1) d;毒死蜱微球对白纹伊蚊3龄幼虫的毒杀作用强于乳油且持效期长,1.2 mg/L的毒死蜱微球水解85 d后处理白纹伊蚊3龄幼虫的死亡率高达76.6%,高于相同浓度、相同条件乳油的处理(53.3%),具有良好的持效性。     

江西胜红蓟黄脉病病原的分子鉴定

为明确引起江西赣州地区胜红蓟上黄脉症状的病原,利用PCR技术,从3个样品上均扩增到双生病毒的约500 bp特异片段,并选择病毒分离物JX01进行全序列测定。结果表明,JX01 DNA-A全长2 754 nts,符合双生病毒DNA-A的结构特征,与中国番木瓜曲叶病毒(Papaya leaf curl China virus,Pa LCCNV)分离物Pa LCCNVFz10同源性最高,达99.7%。利用特异性引物对JX01样品进行卫星分子的扩增,得到大约1 300 bp的片段(JX-Gz01β)。序列分析表明,JX-Gz01β全长1 314 nts,与伴随中国胜红蓟黄脉病毒的卫星分子(Ageratum yellow vein China betasatellite,AYVCNB)Hn9分离物的同源性最高,为94.3%。系统关系树分析表明,JX01与Pa LCCNV各分离物聚类为一个大分支,而与其他病毒亲缘关系较远。这是江西首次报道Pa LCCNV侵染胜红蓟。     

烟草花叶病毒及其弱毒株基因组的cDNA克隆和序列分析

 利用RT-PCR技术获得了覆盖整个烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)强毒株TMV-W、2个弱毒株TMV-017和TMV-152基因组(RNA)的cDNA克隆。序列测定结果表明,强、弱毒株全长均为6 395个核苷酸,具有4个开放阅读框(open readingframe,ORF),分别编码126、183、30、17.6 kDa蛋白。TMV-W和普通株系TMV-U1的基因组同源率达到98%,TMV-W为普通株系。TMV-017、TMV-152基因组发生变异的部位主要在126/183 kDa ORF中。和TMV-W相比,TMV-017仅在126 kDa蛋白ORF中有18个碱基发生变异,其中10个碱基引起氨基酸的改变;而TMV-152在183 kDa ORF中有16个碱基发生变异,其中有11个引起氨基酸的改变。TMV-017和TMV-152有11个共同变异的碱基,其中有8个引起氨基酸的变异。TMV-152在30 kDa ORF中有1个碱基发生变异而引起氨基酸的改变。其它区域,三者完全相同。     

水稻瘤矮病毒 P3、P7、P8、Pn9、Pn10、Pn11、Pn12 的酵母双杂交载体的构建及自激活效应检测

将编码水稻瘤矮病毒P3、P7、P8、Pn9、Pn10、Pn11、Pn12的S3,S7,S8,S9,S10,S11和S12基因分别克隆到酵母表达载体pGBKT7和pGADT7中,转化AH109酵母细胞,结果显示:除pGBK-S10转化子可以在SD/-Trp和SD/-His营养缺陷固体培养基上正常生长外,其它转化子均只能在SD/-Trp或SD/-Leu营养缺陷固体培养基上正常生长.通过α-半乳糖苷酶活性分析揭示,除pGBK-S10可以在SD/-Trp/X-α-Gal平板上生长并变蓝外,其它均不变蓝.结果证实:RGDV Pn10在酵母细胞中具有转录激活活性,融合GAL4的RGDV Pn10蛋白可以在酵母细胞内激活HIS3和MEL1报告基因的表达.暗示该蛋白可能在病毒的侵染和复制过程中参与调控病毒或寄主基因的转录表达.     

南方水稻黑条矮缩病毒非结构蛋白的亚细胞定位研究

病毒蛋白的亚细胞定位可以反映病毒的某种功能,是研究病毒功能的重要依据。借助农杆菌的介导,将南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus, SRBSDV）可能编码的6种非结构蛋白分别在本氏烟细胞中表达,通过荧光共聚焦显微镜观察所表达的蛋白亚细胞定位情况。 结果表明：Pns52、Pns91定位相似,主要定位于细胞质,在细胞质中形成较大的颗粒状聚集体;Pns6、Pns71、Pns72和Pns92定位相似,分散于整个细胞,主要定位于细胞质中或膜上,均形成丝网状结构;WoLF PSORT对比分析显示它们可能都是膜内在蛋白（Integral membrane protein）,此外,Pns6在细胞质中还可以形成颗粒状的聚集体。     

利用酵母双杂交系统筛选本氏烟中与RGSV P5互作的蛋白

【目的】水稻草状矮化病是由水稻草状矮化病毒引起的，给粮食产量造成了严重威胁。RGSV P5是该病毒的沉默抑制子，在抵抗寄主RNA沉默中发挥重要作用。筛选、鉴定与水稻草状矮缩病毒（RGSV）沉默抑制子P5互作的寄主蛋白，为揭示水稻草状矮化病毒致病的分子机制提供理论基础，为该病毒病的防治提供有效策略。【方法】利用酵母双杂交技术筛选与水稻草状矮化病毒P5互作的寄主蛋白。提取感染水稻草状矮化病毒的水稻叶片的总RNA。依据P5基因的CDS序列设计特异性引物。利用RT-PCR技术获得P5基因，将P5基因构建到酵母诱饵表达载体pGBKT7上，利用双酶切鉴定诱饵质粒。将诱饵载体pGBKT7、pGBKT7-P5、重组质粒pGBKT7-P5/pGADT7分别转化到酵母感受态细胞Y2H Gold中，通过观察其在缺陷培养基SD/-Trp、SD/-LeuTrp/上的生长情况及在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal上的显色情况检测诱饵质粒的毒性和自激活活性。将烟草酵母cDNA文库质粒转化到含诱饵载体pGBKT7-P5的酵母感受态细胞中，先后用不同缺陷型培养基SD/-Leu/-Trp、SD/...