检测猪圆环病毒2型抗体SPA胶体金免疫层析方法的建立

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,并将其标记SPA,将金标SPA包被至玻璃纤维膜上,将猪圆环病毒2型（PCV-2） Cap蛋白、抗SPA抗体分别包被至硝酸纤维素膜的检测线与质控线上,建立了一种检测PCV-2抗体的胶体金免疫层析方法。检测阳性样品时,在检测线和质控线处均出现红色条带;检测阴性样品时,仅在质控线处出现红色条带。该方法与ELISA相比,其灵敏度为89.19%,特异性为100%,并且与PCV-1、猪瘟病毒（HCV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）阳性血清无交叉反应。     

沙丁胺醇单克隆抗体的制备、鉴定及其免疫学检测方法的建立

本研究采用碳二亚胺法将沙丁胺醇(Salbutamol．Sal)分别与钥孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联．制备免疫抗原(Sal-KLH)、(Sal-BSA)和包被抗原(Sal-OVA)。用免疫抗原免疫8周龄雌性Blab／c系小鼠，通过四次免疫后．将小鼠断尾采血．以包被抗原包被板，用间接ELISA法选出血清具有抗Sal的高阳性鼠，取这些小鼠的脾细胞与SP2／O细胞融合．通过检测、克隆、筛选等步骤生产抗Sal单抗。通过以上步骤得到3株具有稳定、特异分泌抗Sal的单克隆抗体．分别命名为2A6(A株)、383(B株)、2H7(C株)。应用3株抗Sal单抗，基于间接抑制ELISA方法．建立沙丁胺醇免疫学检测方法。通过对此方法中的相关条件进行优化．可以使本检测体系对沙丁胺醇的检测范围达到1．25～1280ng／m1．表明基于此原理建立的检测方法可以用于动物性食品沙丁胺醇残留的普查。     

蓝舌病病毒荧光定量RT-PCR检测技术

蓝舌病是一种侵害反刍动物的虫媒传染病,被世界动物卫生组织(Office International des Epizooties,OIE)列为上报疾病,我国将其列为一类动物疫病.本研究利用计算机软件分析获取蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)核酸检测的保守靶序列,设计引物和TaqMan荧光探针,建立了BTV荧光定量RT-PCR技术,进行了特异性、敏感性、重复性等实验评价,并对动物样品进行检验.结果显示,该技术可有效检出不同血清型BTV,与流行性出血病病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus,EHDV)无交叉反应;对RNA标准品的检测灵敏度为102 copies;重复检测CV<5%,可对动物样品进行有效检测.因此,所建立的BTV TaqMan/荧光定量RT-PCR技术可为蓝舌病诊断提供一种快速、可靠的病原检测手段.     

犬细小病毒VP2截短基因的原核表达及表达蛋白抗原性分析

采用PCR方法扩增了犬细小病毒（Canineparvovirus,CPV）2段VP2截短基因,将2段短基因片段分别克隆至原核表达载体pET-32a（＋）中,表达质粒命名为pET-32a-306和pET-32a-363。将pET-32a-306和pET-32a一363转化至宿主菌E．coliBL21（DE3）,IPTG诱导后进行SD孓PAGE和Westernblotting分析。结果显示,融合蛋白相对分子质量大小为30000和33000;与全长VP2蛋白相比,目的蛋白得到了高效表达,且都为可溶性表达。West—ernblotting结果表明,该蛋白融合表达并且有很好的免疫反应原性,可为CPV亚单位疫苗和免疫学诊断方法的研究提供候选抗原。     

牛病毒性腹泻病病毒荧光定量PCR检测体系的建立与评价

基于实时荧光定量PCR技术建立了一种有效地检测牛病毒性腹泻病病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)核酸的方法.对BVDV基因组进行同源比对,选取5'UTR区作为扩增目的区,经软件分析后设计特异扩增引物,扩增片段长度为203 bp.选用SYBR染料作为扩增时信号指示剂,经扩增曲线分析表明,建立的方法可有效地检测BVDV.检测体系可检测到10~2 copies/μL的样品拷贝数.故本研究建立的BVDV实时定量检测体系可用于易感动物,牛源血液生物制品及其他可能感染或污染BVDV样品的检测.     

猪圆环病毒2型间接ELISA抗体检测方法的建立与初步52用

本研究利用原核表达的猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白作为标准抗原蛋白建立PCV2抗体检测方法,同时对建立的检测方法的相关条件进行了优化.通过优化确定抗原的最佳包被浓度为10μg/mL,血清的最佳稀释度为1:160,最佳封闭试剂为10%牛血清,二抗的使用浓度为1:1000,血清及二抗的最佳反应条件为37℃孵育60 min,底物的最佳反应条件为37℃反应10 min,cutoff值为0.25.通过批内及批间重复性的评价,变异系数均小于0.1,表明本检测方法具有较高的可重复性.与标准的检测试剂盒相比,检测临床样本时,本检测方法与对照试剂盒检测结果符合率为91.7%.结果表明,建立的检测方法可用于临床PCV2抗体的检测.     

生物炭挤压成型机的设计与试验

利用螺旋挤压成型原理,设计一种农作物秸秆生物炭挤压成型机。通过对螺旋喂料器、螺杆、成型出口等关键部件的分析计算,确定螺旋喂料器、螺杆、保型筒等关键部件和机构的运动参数和结构参数,并试制样机。以农作物秸秆生物炭为试验材料,以不同螺杆类型、不同含水率和粘结剂添加量为试验因素,采用抗压强度和抗跌碎性为评价指标,设计正交试验,对该挤压成型机性能进行试验。结果表明,当采用等距不等深螺杆、粘结剂添加量为25%左右、含水率为35%左右时,样机的生产率为215 kg/h,成型样品的密度为1.06 g/cm3,抗压强度为0.16 MPa,抗跌碎性为98.23%,各项指标满足生物炭成型标准或设计要求。     

沙丁胺醇单克隆抗体的制备及其免疫学检测方法的建立

沙丁胺醇（Salbutamol，Sal）又名舒喘宁，化学名为4-羟基-5-羟甲基-α（叔丁胺）甲基苯乙醇胺，是人工合成的具有β2-受体激动剂样作用的肾上腺素能药物。此类药物常用于临床治疗如哮喘等呼吸系统疾病。试验证实沙丁胺醇对动物具有促进骨骼肌生长，减少脂肪蓄积等作用。因而国内外不少养殖场都非法使用本类药物。     

克伦特罗单克隆抗体的制备及其初步鉴定

【研究目的】制备克伦特罗单克隆抗体（McAb）,为建立克伦特罗残留检测方法奠定基础。【方法】用偶氮化法将克伦特罗与钥孔血蓝蛋白（KLH）、牛血清白蛋白（BSA）及卵清白蛋白（OVA）偶联,制备完全抗原,免疫Balb/c小鼠,建立杂交瘤细胞株以制备单抗,并对单抗的特异性、交叉反应性及抗原识别位点等特性进行了初步鉴定。【结果】获得了1H5、1H7、1D6、2F10四株杂交瘤腹水效价均在1：105以上。对沙丁胺醇交叉反应性测定,最小的是1D6,只有2.32%的交叉反应性。单抗相对亲和力1D6〉1H5〉1H7〉2F10。抗原识别位点分析结果表明,这四株单抗至少识别两个不同的抗原位点。选用1D6初步建立了竞争ELISA检测方法,检测限可达1ng/ml,为进一步研制残留检测试剂盒奠定了基础。