猪精子RNA提取的初步研究

实验采用Trizol一次法或试剂盒提取猪精子的总RNA,然后通过RT-PCR扩增的方法,检测精子和睾丸组织中鱼精蛋白(PRM-1)的mRNA;使用不同数量的精子,检测在本实验条件下能扩增出PRM-1带所需要的最小精子数量;通过OD260/280的测算,判断不同提取方法所得RNA的纯度;通过琼脂糖电泳得到精子RNA与睾丸、卵巢组织RNA的电泳图。实验结果表明:在使用RNA沉淀剂时,1.51×107精子可检测到PRM-1的mRNA,不使用沉淀剂则需要3.02×107精子才检测到;使用Trizol一次法提取的精子总RNA纯度较常规Mini试剂盒(W6221)高;本实验首次得到猪精子总RNA的普通琼脂糖凝胶电泳图。初步研究的结果表明,Trizol一次法可用来提取精子总RNA供进一步研究;猪精子RNA的28S和18S片段与睾丸、卵巢组织无明显差异。     

不同离心液对猪孤雌激活胚胎的冷冻效果

以猪孤雌激活胚胎为材料,经体外成熟、电激活,选取电激活后3d(6⁸cell)胚胎分别放入0.28mol/L的蔗糖离心液或无蔗糖离心液中离心处理后,继续培养5d,取扩张囊胚进行玻璃化冷冻保存。结果显示,在囊胚形成率上,无蔗糖组(19.86%)略高于蔗糖组(18.83%),差异不显著(P>0.05);胚胎复苏率上两者差异不显著,但蔗糖组(43.33%)明显好于无蔗糖组(29.63%);在解冻后胚胎内细胞破损率上,无蔗糖组(20.18%)低于蔗糖组(29.13%),差异不显著(P>0.05)。因此,离心液中添加蔗糖,对后续囊胚形成无影响,在一定程度上提高了解冻囊胚复苏率,但没有降低内细胞的破损程度。     

猪精子和睾丸组织RNA的初步分析

试验采用Trizol一次法提取猪精子和睾丸组织的总RNA,然后通过RT-PCR扩增的方法,检测精子和睾丸组织中Protamine-1(PRM-1)、Protamine-2(PRM-2)、Clusterin、Heat shock protein 90(HSP90)、C-myc基因的mR-NA是否存在;通过不同精子数量的使用,检测在本试验条件下扩增出清晰PRM-1带所需要的适宜精子数量;通过琼脂糖电泳检测精子与睾丸组织RNA的电泳特征.结果,猪睾丸组织中有PRM-1、PRM-2、Clusterin、HSP90、C-myc的mRNA,而射出的猪精子(上游处理)本试验只检测出PRM-1的mRNA;在使用RNA沉淀剂时,3.0×107～6.5×107精子可得到清晰的PRM-1条带;本试验首次得到猪精子总RNA的普通琼脂糖胶电泳图.初步研究的结果表明:射出猪精子中存在的RNA种类与睾丸组织中存在的RNA种类差异大;猪精子RNA的18S和28S片段与睾丸组织无明显差异.猪精子的RNA需要更多的研究.     

尼罗罗非鱼精巢支持细胞分离培养体系建立及优化

本研究分离培养尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)精巢支持细胞(Sertoli cells, SCs),建立并优化尼罗罗非鱼精巢支持细胞分离培养体系。无菌条件下,取发育至第Ⅲ期的尼罗罗非鱼精巢,PBS清洗后,剪碎精巢组织,0.25%胰蛋白酶消化,用含10%犊牛血清(Newborn bovine serum, NBS)的L-15培养液终止消化,过滤、离心,获得细胞。差速贴壁法获得SCs后,在26℃、无CO2饱和湿度恒温培养箱中培养。分别采用含10% NBS的L-15、M199、F12培养液,含5%、10%、15% NBS的L-15培养液,含1%罗非鱼血清的L-15+10% NBS培养液培养尼罗罗非鱼SCs。各组每2 d取细胞计数,绘制SCs生长曲线;甲基绿染色,倒置显微镜下观察SCs的形态。尼罗罗非鱼SCs培养1~2 d,细胞贴壁;培养3~5 d,细胞完全贴壁并迅速增殖。单个SCs呈不规则多边形,其核位于胞质中央,呈卵圆形,胞质中可见吞噬颗粒和空泡,空泡聚集于支持细胞胞质的两极或散布于核的四周。SCs在L-15培养液中贴壁生长,在F12、M199培养基中较难贴壁。与F12、M199培养液相比,L-15培养液更有助于尼罗罗非鱼SCs生长增殖(P<0.01)。与添加5%和15% NBS相比,在L-15培养基中添加10% NBS更有助于尼罗罗非鱼SCs生长增殖(P<0.05)。与未添加尼罗罗非鱼血清相比,在10% NBS+L-15培养中添加1%尼罗罗非鱼血清,能显著促进SCs生长增殖(P<0.05)。研究表明,采用胰酶消化差速贴壁法获得尼罗罗非鱼精巢支持细胞,10% NBS+1%罗非鱼血清+L-15培养液培养,能显著促进尼罗罗非鱼精巢支持细胞生长增殖。     

食源性单增李斯特菌lismff_0038基因克隆及序列分析

单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)作为四大重要食源性病原菌之一,对公共安全及畜牧业发展威胁极大。其lismff_0038是新发现的一个潜在毒力因子,与LM的神经感染和母胎感染密切相关。对食源性单核细胞增多性李斯特菌LM5567的lismff_0038基因进行克隆和生物信息学分析,为功能验证提供基础。根据GenBank中收录的lismff_0038基因序列设计特异性引物,利用PCR方法对食源性单核细胞增多性李斯特菌LM5567的lismff_0038基因进行扩增,将扩增产物克隆到pMD19-T载体,进行PCR、双酶切鉴定及序列测定,并对基因核苷酸序列和蛋白序列进行分析。结果显示,食源性单核细胞增多性李斯特菌LM5567的lismff_0038基因序列全长为988 bp。LM5567的lismff_0038核苷酸序列与02-6680株(4b,奶酪,加拿大)、10-0811株(1/2b,螃蟹,加拿大)、10-0809株(4b,粪便,加拿大)、81-0558株(4b,脑脊髓液,加拿大)、02-1103株、02-1792株(4b,奶酪,加拿大)、81-0861株(4b,卷心菜,加拿大)相似性91.1%。其推导的氨基酸序列与上述菌株相似性100%。蛋白质二级结构预测表明,LM5567的lismff_0038蛋白为疏水性蛋白,无信号肽,属于跨膜蛋白。表明,克隆了LM5567的lismff_0038基因,为进一步探究lismff_0038基因的功能奠定了一定基础。     

外源根系分泌物对紫花苜蓿根瘤菌共生体系的影响

为筛选诱导紫花苜蓿（Medicago sativa L.）生长结瘤的适宜外源根系分泌物，本试验利用木犀草素、茉莉酸甲酯、季酮酸以及水苏碱+葫芦巴碱混合物5种外源根系分泌物（共生信号物质）对苜蓿根瘤菌ACCC17617（A17）和ACCC17631（A31）诱导，结合室内试验与田间试验，分析外源根系分泌物对根瘤菌的诱导效应，并对苜蓿结瘤特征及生长性状测定，研究外源根系分泌物对紫花苜蓿接种根瘤菌共生体系的影响。结果表明：5种外源根系分泌物能有效提高苜蓿的结瘤数、生物量、蛋白含量以及受诱导的根瘤菌占瘤率。不同物质（或组合）对菌株与苜蓿共生结瘤和苜蓿生长的影响不同，室内条件下木犀草素对苜蓿的生长发育有较好的促进效果。田间试验条件下，经外源根系分泌物诱导后，根瘤菌A31的田间竞争力大于根瘤菌A17。     

体外受精后不同时间收集的牛胚胎的冷冻效果

比较了体外受精后不同时间收集的牛囊胚期胚胎冷冻后的存活率。试验一收集受精后第６，７，８和９天出现的胚胎，分３步加入０．７５ｍｏｌ／Ｌ甘油和０．５ｍｏｌ／Ｌ丙二醇，将胚胎装入０．２５ｍＬ细管后，放入已降温至５℃的冷冻机内，立即以２℃／ｍｉｎ的速率降温至－７℃，停留５ｍｉｎ后植冰。植冰后５ｍｉｎ，以０．３℃／ｍｉｎ的速率降温至－２５℃，取出胚胎，并立即投入液氮中保存。解冻时，先让细管在空气中暴露１０ｓ     

秋菊催花试验报告

秋菊催花试验报告张培媛，孙志欢（山东大学）人们所喜爱的秋菊，一般是在阳历１０月下旬开始透色放花，１１月初盛开，进入观赏期。为了使秋菊提前开花，给国庆节增辉，并使秋菊鲜切花提前上市，我们在１９９１年和１９９２年在山东大学新校苗圃内对秋菊进行了短日照催花...     

牛体外受精胚胎移植后的怀孕率及双胎率

为了测定牛体外受精胚胎移植到受体母牛后的怀孕率和双胎率，本研究共进行了３个胚胎移植试验。试验１，测定新鲜胚胎移植后的怀孕效果。将１６０枚新鲜胚胎移植到８０头受体母牛（每头受体接受２枚胚胎），移植后６０～９０ｄ的怀孕率为６５％（５２／８０），其中双胎率为５０％（２／５２）。试验２，测定经室温保存４～１８ｈ的胚胎移植后的怀孕效果。供试验用的６８头受体母牛均于移植前７ｄ（即发情当天）进行人工授精。移植时每头受体牛接受１枚胚胎。移植后４０～６５ｄ的怀孕率为７６．５％（５２／６８），其中双胎率为６５．４％（３４／５２）。试验３，测定冷冻胚胎移植后的怀孕效果。将４５４枚冷冻胚胎移植到２２７头受体母牛，每头接受２枚冻胚。移植后５０～６０ｄ的怀孕率为６１．７％（１４０／２２７），其中双胎率为２５％（３５／１４０）。本研究结果表明，用完全体外化技术生产的牛胚胎移植到受体母牛后可获得满意的怀孕率和双胎率，这一技术将为加速向用牛生产的发展开辟一条崭新的途径。