一氧化氮合成酶(NOS)研究方法及其在植物中的应用

一氧化氮(NO)在动植物生命活动中具有重要作用。近年来,其合成途径已成为研究焦点。文章综述了近10年来一氧化氮合成酶(NOS)研究方法及其在植物中的应用,包括生物化学方法、免疫学方法和分子生物学方法,并对其研究前景进行展望。     

应用GDPs转录物标记法进行水稻白叶枯病菌早期侵染表达谱分析

 【目的】揭示水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae,Xoo）在侵染水稻叶组织早期的基因表达谱差异。【方法】采用GDPs-Finder计算法,设计了能够覆盖KACC10331基因组全部ORFs的定向引物（GDPs）,对Xoo与水稻互作1、3和7 d的总RNA进行反转录,对病菌cDNA探针进行Cy3/Cy5选择性标记,与含有371个Xoo致病相关基因的芯片进行杂交。【结果】在水稻侵染的不同时期,Xoo致病相关基因表达谱存在差异。与在NBY中生长相比,Xoo在侵染1、3和7 d时分别有42个（18个上调和23个下调）、51个（29个上调和22个下调）和33个（16个上调和17个下调）基因发生了差异表达;其中5个基因是共有上调表达的,5个是共有下调表达的。推测这些基因的差异表达可能与病菌适应寄主体内环境、生长与定殖以及为害与显症过程有关。【结论】应用GDPs转录物标记技术可以成功地进行Xoo侵染过程的表达谱分析,鉴定出的差异表达的基因可以作为功能研究的靶标基因。     

试论病原物的致病基因

 致病基因(pathogenicity genes)是病原物中决定对植物致病性的有关基因。在侵染植物过程中,病原物致病基因决定了与植物建立寄生关系和破坏植物正常生理功能,调控了对植物趋性、吸附、侵入、定殖、扩展、破坏寄主和显症等病理学过程。     

应答调节蛋白基因flgRRxoo对水稻白叶枯病菌毒性表达的调控作用鉴定

为了阐明水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae,简称Xoo)应答调节蛋白FlgRRxoo的生物学功能,本研究通过基因克隆和序列分析、用标记交换法构建突变体以及表型测定,对flgRRxoo基因进行了分子鉴定。通过设计引物进行特异性扩增,成功地从Xoo野生型菌株PXO99A中克隆了flgRRxoo。FlgRRxoo为N端具有REC结构域的单一结构应答调节蛋白,其基因序列与其他黄单胞病菌中的同源序列高度保守。与PXO99A相比,△flgRRxoo胞外多糖(EPS)合成能力以及对水稻的毒性显著降低,基因互补可以使之恢复;△flgRRxooEPS合成基因gumBDGKM表达均有所下降;但其运动性、胞外纤维素酶和木聚糖酶活性无明显改变。表明FlgRRxoo可能主要通过调控EPS合成能力,影响了病菌在水稻上的毒性。     

水稻白叶枯病菌在离体培养条件下生物膜形成的检测

分析了不同培养和测试条件(塑料和玻璃表面、培养时间、培养温度和培养基)对水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae,Xoo)生物膜形成的影响,并测定了不同地区来源的Xoo野生型菌株、基因缺失突变体的生物膜形成。结果表明,在聚苯乙烯表面生长、用M210培养基在23 ℃下静止培养24 h是Xoo生物膜形成比较适宜的条件;不同地区来源的菌株生物膜形成能力不同;鞭毛相关基因fleQxoo、fliExoo和rbfCxoo以及H2O2降解调控基因oxyRxoo的缺失突变均影响生物膜形成。     

水稻白叶枯病菌转录调控因子基因fleQxoo和σ54因子基因rpoNxoo的分子鉴定

 为了阐明水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,简称Xoo)鞭毛生物合成及运动性的调控机理,本研究首先通过基因克隆、序列分析、缺失突变及表型测定,对转录调控因子fleQxoo和编码σ⁵⁴因子的基因rpoNxoo进行了分子鉴定。通过基因特异性扩增,成功地从Xoo菌株PXO99^A中克隆了fleQxoo和rpoNxoo。其基因序列与其它黄单胞病原菌中的同源序列高度保守。FleQxoo是NtrC家族激活蛋白成员之一,具有与σ⁵⁴作用的结构域和DNA结合保守结构域(HTH)。用标记交换法构建了△fleQxoo和△rpoNxoo基因缺失突变体。与PXO99^A相比,△fleQxoo和△rpoNxoo鞭毛产生能力丧失,运动性减弱,基因互补可以使之恢复;但其胞外纤维素酶和木聚糖酶活性以及对烟草叶片组织的致敏性无明显改变。因此,FleQxoo和σ⁵⁴主要参与了鞭毛生物合成及其运动性的调控。     

水稻白叶枯病菌毒性基因的克隆和功能分析

 通过DNA重组,用载体质粒pBR322和水稻白叶枯病菌(Xanthomonas campestris pv.oryzae Dye)毒性基因突变体XcoM3105带有转座子Tn5的毒性基因片段,构建了11.6kb的探针质粒pVIRl。用α-32P-dATP标记该探针,从构建在粘粒pSa747上的病菌野生型菌株JXO Ⅲ染色体基因文库中,通过菌落原位杂交和Southern杂交,筛选了8个毒性基因的克隆(pNAX3101~3108。将其中一个毒性基因克隆pNAX3103通过三亲交配接合法转移到XcoM3105中,接合频率为2.06×10^-7。功能互补分析表明,pNAX3103可以互补突变体XcoM3105,恢复致病性,同时也能互补其淀粉酶(Amy)活性表型,由原来的淀粉酶阳性恢复为阴性反应。因此可以认为,被克隆的毒性基因片段具有完整的致病功能,毒性基因与淀粉酶基因之间可能存在着某种负调控关系。     

水稻白叶枯病菌HD-GYP结构域蛋白PXO_03945的功能鉴定

为了揭示水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,简称Xoo)环二鸟苷酸(c-di-GMP)信号相关蛋白PXO_03945的生物学功能,本研究通过基因同源重组和无标记交换,对PXO_03945基因进行了缺失突变,对野生型、突变体和互补菌株进行表型测定,分析该基因缺失突变对病菌胞内c-di-GMP水平、致病性、运动性、胞外多糖产生和生物膜形成的影响。结果表明,PXO_03945蛋白具有参与c-di-GMP降解的磷酸二酯酶(PDE)的HD-GYP结构域和功能未知的DUF3391结构域。全长基因缺失可导致体内c-di-GMP浓度明显上升。与野生型相比,ΔPXO_03945对水稻品种日本晴的致病性显著下降,而游动性增强,胞外多糖产生和生物膜形成增加。基因互补可以使之恢复。因此,HD-GYP结构域蛋白PXO_03945可能通过降解胞内c-di-GMP,正向调控了致病性,负向调控了运动性、EPS产生和生物膜形成能力。     

水稻白叶枯病菌北方菌株遗传多样性rep - PCR分析

为了揭示水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)北方菌株的遗传结构组成,利用rep - PCR 技术对103个从辽宁、吉林、河北、山东稻区采集的Xoo菌株、9个标准小种(R1 -R9)代表菌株和13个水稻细菌性条斑病菌(X.oryzae pv.oryzicola,Xoc)菌株进行了遗传多样性分析.结果表明,ERIC -PCR和BOX-PCR分析均能较好地揭示出测试菌株的遗传多态性,分别获得了84种和90种分子谱型;在相似系数为70%时,ERIC -PCR将所有测试菌株聚类为17个簇群,其中1个为优势簇群;BOX - PCR将测试菌株聚类为10个簇群,其中2个为优势簇群.在相似系数为50%时,Xoo与Xoc测试菌株分别聚类为2个不同的簇群.