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【目的】旨在探究日粮中添加益生菌对猪流行性腹泻病毒(PEDV)—德尔塔冠状病毒(PDCoV)二联灭活疫苗免疫效果及宿主肠道微生物的作用。【方法】以42 d SPF级雌性昆明鼠为试验材料,以基础日粮为对照组(NC组),分别在基础日粮中添加EM益生菌(EM组)、枯草芽孢杆菌(Bac组)、乳酸杆菌(Lac组),在试验1和14 d,分别对小鼠免疫PEDV—PDCoV二联灭活疫苗,检测分析7,14,21,28 d小鼠血液中PEDV和PDCoV的中和抗体与血清免疫因子水平,16S rRNA高通量测序分析肠道菌群差异,以及肠上皮细胞绒毛、隐窝变化。【结果】(1)与对照组(NC组)相比,饲喂不同益生菌小鼠血清中PEDV和PDCoV的中和抗体水平均有不同程度提高,其中EM组小鼠血清中PEDV和PDCoV的中和抗体水平要明显高于其他组(P<0.01);(2)血清免疫因子表达量分析发现,EM组小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-5、IL-6、IL-10、CXCL1表达量均极显著高于NC组(P<0.01);(3)肠道形态结果显示,益生菌试验组回肠绒毛长度均显著大于NC组(P<... 相似文献
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新现猪Delta冠状病毒RT-PCR检测方法的建立及其应用 总被引:2,自引:0,他引:2
【目的】猪Delta冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus, PDCoV)是近年来新发现的可引起猪只,特别是新生仔猪腹泻的冠状病毒,其引发的腹泻具有较高的发病率和死亡率,是造成新生仔猪死亡的重要原因之一。试验拟建立新现PDCoV RT-PCR检测方法,并调查当前江西腹泻猪群中PDCoV的感染情况。【方法】通过对GenBank数据库中PDCoV全基因组序列的比对分析,找出保守序列,用Primer 3.0在线软件设计1对扩增PDCoV核衣壳(N)蛋白基因片段的特异性引物,基于该引物建立PDCoV RT-PCR检测方法;用建立的方法检测腹泻猪粪便及肠道样品,挑选阳性扩增产物进行克隆、测序;用本试验获得的PDCoV序列与其他国家或地区的PDCoV序列以及猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)共同构建进化树,分析PDCoV各毒株及其与PEDV和TGEV之间的进化关系;以PEDV、TGEV、猪库布病毒(PKoV)、猪星状病毒(PAstV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)及猪瘟病毒(CSFV)RNA为模板验证引物的特异性;构建PDCoV核衣壳蛋白基因片段重组质粒,并以系列稀释的重组质粒为模板确定所建立的PDCoV RT-PCR方法的敏感性;应用建立的RT-PCR方法调查249份2012-2015年江西省猪群腹泻样品中PDCoV的存在情况,随机抽取一定数量的RT-PCR阳性扩增产物进行克隆、测序进一步验证反应的特异性。【结果】①以腹泻猪粪便样品RNA为模板,应用所设计的特异性引物扩增出了329 bp的单一条带,与预期目的片段大小一致,扩增产物经克隆后测序,将获得的序列与NCBI GenBank数据库序列进行比对,比对结果表明试验所获得的序列与数据库中PDCoV序列的同源性高达99.1%,证明所扩增的序列属于PDCoV;②将8条本试验获得的PDCoV N基因片段序列与18株其他国家或地区的PDCoV毒株以及PEDV、TGEV的相应N基因片段序列构建进化树,结果表明26条PDCoV序列属于同一个分支,而PEDV和TGEV则分别属于不同的分支。试验获得的PDCoV序列与韩国PDCoV毒株KNU14-04亲缘关系最近,同源性高达99.1%;与两株香港毒株HKU 15-44和HKU 15-155亲缘关系相对较远;③本试验建立的RT-PCR方法特异性强,仅能扩增出PDCoV,而对PEDV、TGEV、PKoV、PAstV、PRRSV及CSFV核酸无交叉扩增现象;④所建立的RT-PCR方法灵敏度高,将含扩增片段的重组质粒以1.0×106拷贝/μL为起始浓度依次10倍稀释至1.0×101拷贝/μL作为模板验证方法的灵敏度,结果表明所建立的方法对PDCoV最低可检出量为1.0×103拷贝/μL;⑤应用建立的RT-PCR方法检测了249份2012-2015年采集自江西省各地区的腹泻母猪粪便及腹泻仔猪粪便/肠道样本,结果显示腹泻样本中PDCoV的检出率为31.33%(78/249),母猪粪便中PDCoV的检出率(27.78%)稍低于仔猪粪便及肠道样品PDCoV的检出率(31.92%),最早可从2012年的样品中检测出PDCoV。【结论】试验成功建立了检测新现PDCoV的RT-PCR方法;应用所建立的RT-PCR方法检测了249份2012-2015年江西地区猪群临床腹泻样品中PDCoV存在情况,结果表明PDCoV是一种普遍存在于腹泻猪群中的病毒;研究建立的RT-PCR方法对猪群PDCoV的临床诊断和流行病学调查等具有应用价值。 相似文献
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为了解近年来江西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)分子流行病学和其遗传变异情况,本次调查于2016-2017年从江西省各地区规模化猪场采集453份疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的病料,采用RT-PCR方法对所有病料进行检测。结果发现,其中321份病料为PRRSV阳性,阳性率为70.86%,各地区的阳性率在19.15%~84.85%之间。挑选14份阳性样品测序后,经ORF5基因序列分析,江西地区各PRRSV毒株ORF5基因的核苷酸同源性为83%~100%,PRRSV流行毒株与参考毒株的同源性在59.9%~98.5%之间。基于ORF5基因的进化树分析表明,14个测序毒株均为美洲型毒株,其中有4株为基因亚型Ⅰ,即高致病性毒株(HP-PRRSV);3株为基因亚型Ⅱ,即经典毒株;3株为基因亚型Ⅲ,即NADC30-like毒株;4株为新出现的基因亚型Ⅳ。氨基酸序列比对分析表明,基因亚型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ毒株ORF5基因编码的GP5蛋白氨基酸在3个表位及2个重要的抗原相关区域存在较大变异,其中以NADC30毒株为代表的基因亚型Ⅲ毒株和以GD1404毒株为代表的基因亚型Ⅳ毒株均表现出独有的氨基酸变异,这些变异可能会影响GP5蛋白的免疫原性。本次调查结果表明,2016-2017年江西地区PRRSV流行出现了新形势,美洲型毒株出现了多基因亚型共同存在的局面,以高致病性毒株(HP-PRRSV)为主,NADC30-like毒株和新基因亚型等新毒株的比例较高,同时还存在经典毒株;持续实时监测PRRSV的毒株流行和变异情况,可为临床诊断、药物和疫苗开发及PRRS的科学防控提供依据。 相似文献
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为研究鹅致病性大肠杆菌(E.coli)耐药性及其整合子,本实验采用Kirby-Bauer法检测1株鹅致病性E.coli对22种抗菌药物的敏感性,并对Ⅰ类整合子和qacE△1-sul1基因进行PCR检测及序列分析。结果表明该菌株只对阿莫西林/棒酸、头孢孟多、氧氟沙星、左氧氟沙星4种药物敏感,对环丙沙星、洛美沙星中度敏感,而对其他16种药物表现多重耐药性。PCR检测结果表明Ⅰ类整合子和qacE△1-sul1基因为阳性,Ⅰ型整合子扩增出约1 200 bp的基因盒插入区片段,将该片段测序与GenBank中的相关序列进行比对,结果表明该基因盒插入区携带arr-3和dfrA27的基因盒,它们分别是编码对利福平和甲氧氨苄嘧啶耐药的蛋白,这提示我们应从基因水平上监测细菌的耐药情况。 相似文献
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为调查江西省副猪嗜血杆菌的感染情况,从而为江西副猪嗜血杆菌病的防冶提供基础.从江西省32个规模化养猪场的80份表现纤维素性炎症的病料中分离得到了20株革兰氏阴性杆菌,经细菌形态、生化反应及PCR鉴定.结果表明分离菌为副猪嗜血杆菌,16S rRNA序列与NCBI上公布的序列同源性在97%左右.生物学特性研究表明,该菌只能... 相似文献
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根据GenBank上已发表的鸡贫血病毒Cux-1株基因组序列设计并合成了1对特异性引物,通过PCR扩增出vp2基因,将扩增出的片段克隆到pGM-T载体上,通过测序分析证实该片段与鸡贫血病毒Cux-1株的vp2基因序列一致。将克隆的W2基因亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)上并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,表达的融合蛋白进行SDS-PAGE和Westernblot分析,并用镍柱在天然状态下进行了纯化。结果表明,表达的融合蛋白分子量约为45ku,能与鸡贫血病毒阳性血清发生反应。 相似文献
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根据Gen Bank中的副猪嗜血杆菌hhd A的基因序列,设计并合成l对特异性引物,对从江西分离的HPS的hhd A基因进行扩增、克隆、测序、生物信息学分析和原核表达。测序结果表明,扩增的目的基因大小为1 797bp,共编码氨基酸599个氨基酸。与Gen Bank上公布的ZJ0906株(CP005384.1)中对应的核苷酸序列同源性为99.8%,氨基酸同源性99.6%。生物信息学分析表明,HPS hhd A蛋白是一种混合型结构蛋白,含有α-螺旋、β-折叠、β转角和无规则卷曲;综合柔性区域、亲水性位点、抗原指数和表面可能位点预测了hhd A蛋白可能的B细胞抗原表位的优势表位。将目的基因转入原核表达载体p ET-32a(+)构建重组原核表达质粒p ET-32a(+)-hhd A,将重组质粒转化到BL21(DE3)中,进行IPTG诱导表达,经过SDS-PAGE电泳结果显示表达的融合蛋白约80 k D。为进一步研究HPS hhd A生物学功能及抗体制备和开发hhd A基因工程产品奠定了基础。 相似文献
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根据GenBank数据库中的新现猪圆环病毒3型(PCV-3)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的OFR2基因设计了2对扩增PCV-3和PCV-2的特异性引物,通过优化各反应条件,建立同时检测PCV-3和PCV-2的双重PCR方法。敏感性和特异性结果显示,该方法对PCV-3和PCV-2的最低核酸检测量均为1.0×103拷贝/μL,而对猪伪狂犬病毒(PRV)、猪delta冠状病毒(PDCoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)及猪瘟病毒(CSFV)的扩增结果均为阴性。应用所建立的双重PCR检测了临床上256份样品,结果表明,PCV-3和PCV-2感染的阳性率分别为0.78%(2/256)和86.3%(221/256),仅有1份样品为PCV-3和PCV-2混合感染,混合感染阳性率为0.39%(2/256)。试验结果表明,本研究建立的PCR方法敏感、特异,适于临床样品检测,为猪群中PCV-3和PCV-2的临床快速诊断和流行病学调查提供了一种工具。 相似文献