橘小实蝇蜕皮激素合成通路基因鉴定分析及饥饿对幼虫发育的影响

【目的】蜕皮激素（ecdysone）是昆虫体内一种重要的激素,参与调控昆虫的生长发育,并且能对环境胁迫进行响应。研究旨在明确橘小实蝇（Bactrocera dorsalis Hendel）蜕皮激素合成通路基因（ecdysone synthesis pathway gene）的分布和特定条件下的表达特性,为进一步开展橘小实蝇变态发育与抗逆胁迫机制的研究提供理论支持。【方法】采用RT-PCR和RACE技术克隆蜕皮激素合成通路基因BdCyp302a1、BdCyp315a1和BdCyp314a1,利用实时定量PCR（qPCR）技术检测该合成通路基因BdNvd、BdCyp306a1、BdCyp302a1、BdCyp315a1和BdCyp314a1在幼虫不同发育阶段（幼虫1-8日龄）、不同组织（前胸腺复合体、脂肪体、中肠、马氏管、表皮和气管）和饥饿条件下的表达模式,明确饥饿对幼虫发育的影响。【结果】克隆获得了3个蜕皮激素合成通路基因序列的开放阅读框,分别为BdCyp302a1（GenBank登录号：JQ027284）、BdCyp315a1（GenBank登录号：KC515377）和BdCyp314a1（GenBank登录号：JQ229645）,且上述序列均具备P450典型结构域：Helix-C/I/K、PERF基序、血红蛋白结合位点以及脯氨酸/甘氨酸富集区,其氨基酸序列较为保守。qPCR检测结果显示蜕皮激素合成通路基因BdNvd、BdCyp306a1和BdCyp314a1幼虫末龄阶段表达量显著升高,其最高表达量分别是最低点的7.33、10.89和7.82倍,但在幼虫前4 d表达量差异不显著。而BdCyp302a1和BdCyp315a1在整个幼虫阶段表达量保持相对稳定。对不同组织的研究发现,蜕皮激素合成通路基因在所选的6个组织中均有表达,其中BdNvd、BdCyp306a1和BdCyp315a1在幼虫前胸腺表达量最高,在其他组织中表达量差异不显著;BdCyp302a1在各组织中的表达量由高到低为脂肪体>前胸腺>表皮/马氏管>气管/中肠,该基因在脂肪体的表达量是中肠的30倍;BdCyp314a1在中肠、马氏管和脂肪体内的表达量依次降低,但均极显著高于其他3个组织。橘小实蝇幼虫在饥饿处理12 h后即出现化蛹现象,其化蛹比例随饥饿时间延长而上升。对蛹宽和蛹长的测量中发现,饥饿导致蛹个体显著缩小,但未影响其存活率。同时,饥饿导致蜕皮激素合成通路基因BdNvd、BdCyp302a1和BdCyp314a1表达量在饥饿处理6 h后出现显著上调,并在处理48 h后出现显著下调;但饥饿处理并未影响BdCyp315a1的表达水平。【结论】蜕皮激素合成通路基因在橘小实蝇幼虫组织的表达具有差异性,并参与介导幼虫-蛹的变态过程和对营养胁迫的响应。     

关中农田土壤剖面的主要物理性状研究

为了探明现代长期集约化生产和耕作管理模式下土壤物理状态的变化特征,对关中地区农田0～60 cm剖面范围内的土壤物理特性进行了研究。结果显示：(1) 土壤剖面容重呈现先增大后减小的变化趋势,表层0～10 cm土壤容重最小,为1.34 g·cm^-3,20～40 cm土层容重高达1.67 g·cm^-3,达到了制约根系延伸的极限容重;(2) 土壤紧实度随着剖面深度增加逐渐增大,0～15 cm、15～25 cm、25～45 cm土层范围内的平均值分别为482 kPa、1 647 kPa、2 268 kPa;(3) 土壤饱和导水率随着土层深度增加而逐渐减小,其中0～10 cm土层的饱和导水率最高,平均为0.968 mm·min^-1,且各土层之间的差异达到显著水平。研究表明只有0～10 cm土层土壤结构性较好,而10 cm以下土壤的物理状态具有明显的退化趋势,制约着作物根系的延伸、气体交换和水分的入渗,应予以足够的重视。     

马疱疹病毒1型LAMP检测方法的建立

本试验旨在建立一种检测马疱疹病毒1型（EHV-1）的快速、灵敏、特异的环介导等温扩增技术（LAMP）,同时评价该方法的可靠性。根据马鼻肺炎糖蛋白B（gB）基因特异保守序列设计多对LAMP引物,利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪监测反应进程,进行引物筛选和反应条件的优化,建立能特异性扩增EHV-1 DNA的LAMP检测方法,并加入SYBR GreenⅠ通过肉眼判断结果。该方法在65 ℃恒温下作用50 min,使EHV-1 DNA获得了高效率的特异性扩增,与其他马易感病毒如马疱疹病毒4型（EHV-4）等无交叉反应;且具有极高的灵敏性,可检测到10^-4稀释的目标病毒,比普通PCR的灵敏度高10倍;反应结束后加入SYBR GreenⅠ肉眼观察的结果与LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪监测结果一致。通过将4份临床样品的LAMP检测结果与已得到验证的PCR结果进行比对,结果显示符合率为100%。本研究建立的LAMP检测方法具有快速、特异、灵敏、简单易操作且设备要求低等特点,具有实地检测EHV-1的前景。     

不同产地野生黑果枸杞资源果实多酚组成分析

【目的】黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）主要分布于中国西北地区。其果实在传统中药中被用来治疗心脏病、月经异常及停经等疾病。近年来,发现多酚特别是花色苷类物质是其主要的功效成分。测定并评价不同产地野生黑果枸杞果实中花色苷等多酚的组成情况,为黑果枸杞的品种选育及开发利用提供依据。【方法】采用分光光度计测定其总酚、总黄酮、总花色苷含量;采用HPLC-MS 方法分析鉴定黑果枸杞酚类物质组成及结构;并根据总多酚含量、总黄酮含量、总花色苷含量及多酚共有峰峰面积分别对26个不同产地黑果枸杞的多酚检测结果进行聚类分析。【结果】26个不同产地的黑果枸杞资源果实的总酚含量、总黄酮含量、总花色苷含量的变化幅度分别为8.25-87.77 mg GAE·g^-1、18.03-60.44 mg RE·g^-1、8.21-31.46 mg·g^-1。不同产地的材料间差异较大,其中青海格尔木乌图美仁、新疆甘河子、新疆巴仑台镇、宁夏贺兰12-01黑果枸杞总酚、总黄酮及总花色苷含量较高;通过HPLC-MS分析鉴定,19个多酚类化合物被鉴定出。其中7个为酰化类花色苷,主要花色苷为Petunidin-3-O-rutinoside (cis-p-coumaroyl)-5-O-glucoside。在所有供试黑果枸杞不同产地的材料中共检测到12种共有酚类化合物,其中Petunidin-3-O-rutinoside (cis-p-coumaroyl)-5-O-glucoside在所有供试黑果枸杞中的含量均最高,是黑果枸杞花色苷类多酚的主要成分。各产地样品HPLC特征图谱相似,有个别质量较差的情况存在;聚类参数不同,聚类结果略有差异。根据总酚含量、总黄酮含量、总花色苷含量聚类,聚为7类,甘肃民勤中渠、新疆喀什、宁夏贺兰12-1聚为第六类,新疆甘河子单独聚为第七类,该两类总酚、总黄酮及总花色苷含量均含量分别介于57.74-87.77 mg·g^-1、41.52-55.46 mg·g^-1和12.25-28.54 mg·g^-1。总酚、总黄酮及总花色苷含量都很高,特别是新疆甘河子产地,可作为以多酚和花色苷含量为指标的优质良种材料。根据共有峰面积共聚为5类,其中宁夏贺兰12-1、青海格尔木乌图美仁、新疆甘河子为一类,该类峰面积很高,其中主成分峰面积介于2 350.84-3 092.94。新疆巴轮台镇单独一类,其主成分峰面积高达为3 579.96。【结论】26个不同产地的黑果枸杞中多数富含多酚类物质,特别是酰化矮牵牛素花色苷含量丰富,是较好的开发富含花色苷类多酚的功能性食品资源。     

苹果光响应转录因子MdHY5表达及蛋白互作分析

【目的】克隆苹果光响应过程中关键的bZIP（basic-leucine zipper）转录因子MdHY5,并进行表达分析及蛋白互作检测,为阐述苹果中MdHY5在光信号过程中的功能及作用机制奠定基础。【方法】对苹果中具有bZIP保守结构的基因设计半定量引物进行表达分析,筛选具有光响应的bZIP转录因子。对光响应的bZIP家族基因进行BLAST比对,根据同源比对分析将目的蛋白命名为MdHY5,同时对cDNA序列设计引物进行克隆;利用MEGA5软件将MdHY5蛋白与拟南芥基因组中所有的bZIP转录因子家族成员进行聚类分析,同时对蛋白进行保守结构域分析;取苹果各组织材料进行MdHY5时空表达分析;通过对MdHY5启动子序列进行预测分析,并结合拟南芥同源基因芯片数据,进一步利用RT-PCR与半定量PCR检测MdHY5对不同光质的表达响应。将MdHY5连接到原核表达载体PGEX-4T-1上,利用IPTG对转化的大肠杆菌BL21融合蛋白进行诱导表达、蛋白杂交检测,并进行蛋白纯化;利用pull down试验验证MdHY5与MdCOP1蛋白的互作。【结果】通过光响应分析,在苹果中筛选到一个bZip转录因子家族成员,聚类分析显示MdHY5基因与拟南芥AtHY5同源性最高,该基因位于苹果基因组12号染色体上,基因编号为MDP0000586302,与拟南芥AtHY5结构相似,MdHY5也含有4个外显子,3个内含子。该基因cDNA序列长度为1 112 bp,其中5′非编码区长度为214 bp,3′非编码区长度为403 bp,开放阅读框长度为495 bp,编码一个含有164个氨基酸残基的蛋白。蛋白保守域分析显示,MdHY5蛋白C端含有一个典型的亮氨酸拉链结构（bZIP domain）,其中在bZIP结构域的N端含有一个核定位信号区域（NLS domain）。时空表达分析显示MdHY5在各组织中均表达,其中叶片中表达水平最高,花和种子中表达水平较低。利用PLACE对启动子进行了顺式作用元件分析发现,MdHY5启动子上含有G-box、GT-1-box、I-box等多个光响应的作用元件,而定量表达分析显示MdHY5能够被白光、蓝光、紫外光诱导,而红光对MdHY5表达没有明显影响。将构建好的融合蛋白表达载体转化BL21并进行蛋白诱导,菌体经超声波破碎后显示,融合蛋白主要在上清中存在。将诱导的MdHY5-GST蛋白分别与MdCOP1-HIS及pET-HIS蛋白孵育进行pull down试验,结果显示,MdHY5在体外能够与MdCOP1蛋白互作。【结论】MdHY5为光诱导的bZIP转录因子,是拟南芥光形态建成关键转录因子AtHY5的同源基因,与AtHY5具有类似的基因与蛋白结构,在叶中表达量最高,同时对多种光质具有表达响应,能够与MdCOP1互作。     

IPTG诱导浓度、时间对AsiaⅠ型口蹄疫病毒VP1蛋白表达的影响

将口蹄疫病毒VP1基因插入原核表达载体pET-28a中,转化至大肠杆菌BL21.用不同的IPTG浓度与不同诱导时间诱导菌株表达VP1蛋向,分析不同IPTG浓度及不同诱导时间对蛋白表达量的影响,以确定最佳表达条件.结果表明,在一定范围内,随IPTG浓度的增高,表达量并不会随之增大;而在菌体对数生长期内,随诱导时间的延长,表达量会随之增大.最后确定当IPTG浓度为3 mmol/L,诱导表达到最长时间9 h时,VP1蛋白表达量最大.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株膜基质蛋白单克隆抗体的研制

为制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株单克隆抗体,用纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株免疫BALB/c小鼠,最后一次免疫后第3天取其脾细胞与SP2/0细胞在聚乙二醇作用下融合,通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和间接免疫荧光试验（IFA）筛选,以有限稀释法克隆3次,制备单克隆抗体,并对制备的单克隆抗体进行鉴定。结果表明获得了2株分泌PRRSV膜基质蛋白特异性抗体的杂交瘤细胞,命名为1D12、5H5,经鉴定其抗体亚型分别为IgG2b、IgM,2株均为κ链,腹水ELISA效价分别为1∶107和1∶105。该单克隆抗体与PRV、PPV、PCV、CSFV、JEV无交叉反应。作者成功制备了抗猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株膜基质蛋白单克隆抗体,为进一步建立相关诊断方法奠定了基础。     

贵州地方猪品种HSL基因多态性与屠宰性状的关联性研究

本研究旨在分析HSL基因多态性与地方猪品种瘦肉率之间的相关性。采用RFLP方法,以二元杂交猪（长白猪×大约克猪）为对照,对贵州地方猪品种糯谷猪和萝卜猪的HSL基因进行多态性分析。结果表明,贵州地方猪品种HSL基因外显子1中存在BsaH I酶切片段长度多态性,从3个猪群体中都检测到AA、AB和BB基因型,克隆测序后证实,A等位基因于第442 bp处发生了单碱基突变（G→A）,导致氨基酸Val→Ile替换。地方猪品种以A等位基因占优势,杂交猪以B等位基因占优势。将猪胴体性状与HSL基因型之间进行关联分析,结果显示大部分年龄段的猪品种中,BB、AB和AA 3种基因型的瘦肉率和眼肌面积均表现出从高到低的变化趋势,而背膘厚则完全相反。结果提示,HSL外显子1的B等位基因具有增加胴体瘦肉率和眼肌面积、降低背膘厚的遗传效应,可作为贵州地方猪品种瘦肉率的分子标记。     

回归分析法在地下水水质动态预测中的应用

地下水系统是一个复杂的随机系统。根据地下水水质与其影响因素之间存在的相关关系,运用回归分析理论和方法,建立了一个基于多元线性回归分析法的地下水水质动态预测模型,并将该模型用于遵义市海龙坝地下水水质的动态预测。预测结果表明预测精度较高,建立的模型较符合该研究区的实际情况。     

红松单木断面积生长模型

以吉林省汪清林业局金沟岭实验林场62株红松解析木数据为基础,探讨Hegyi竞争指数对红松单木断面积5 a生长量的影响,并构造线性模型。结果表明:在5 a前年龄5、a前直径、5 a前树高、第一活枝高度、第一死枝高度、活树冠长度、竞争指数等变量中,仅有5 a前树高与对数断面积生长量相关性显著,进入模型,其余指标未能进入模型。