油茶丙二酰单酰CoA:ACP转酰基酶基因的克隆与原核表达

【目的】油茶种仁含油率较低且易遭逆性环境等的影响,这些都严重影响和制约了油茶产业的快速发展。丙二酰单酰Co A:ACP转酰酶是脂肪酸合成酶(FASⅡ)复合体的组成酶之一,在脂肪酸合成中起着装载作用,它的酶促反应产物丙二酰单酰ACP是脂肪酸合成关键组成部分。开展该基因的功能研究,能为油茶的分子遗传育种奠定基础。【方法】以油茶品种‘华硕’种子为材料,借助其种子转录组和表达谱数据库,通过RACE技术,克隆丙二酰单酰Co A:ACP转酰酶基因并对该基因进行生物信息学分析。利用常规的酶切连接技术构建基因的原核表达载体,并利用α酮戊二酸脱氢酶(KDH)偶联系统测定表达产物的酶活性。【结果】丙二酰单酰Co A:ACP转酰酶基因的全长c DNA 1 867 bp,含有1 131 bp的开放读码框,编码376个氨基酸,具有58个氨基酸长度的叶绿体转运肽,该基因被命名为Co MCAT(Gen Bank登录号KJ910337)。在malonyl-Co A结合位点和ACP结合位点上分别存在高度保守的基序"GQGXQ"和"GXSXG"。原核表达载体p ET30a-Co MCAT在BL21(DE3)细胞中被成功地诱导表达,目的重组蛋白分子量约为40 k Da。酶活性分析表明,重组蛋白Co MCAT的最佳催化温度为30℃,最佳p H为7.0,比酶活性约为2.384 U·μg-1。【结论】以本实验室构建的油茶转录组数据库为基础,首次克隆获得油茶MCAT基因的全长c DNA序列,构建其原核表达载体在宿主细胞BL21(DE3)中成功诱导表达目的蛋白,并对重组蛋白进行初步的酶活性分析。研究结果为今后进一步深入开展和揭示油茶MCAT基因在油脂合成的代谢过程中的作用奠定基础。     

4个油桐品种光合特性的日变化研究

利用Li-6400便携式光合测定系统,测定了4个油桐品种光合指标的日变化。结果表明：⑴‘葡萄桐’、‘小米桐’、‘对年桐’的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)日变化均呈单峰曲线,‘大米桐’的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)日变化呈双峰曲线;⑵4个品种的胞间CO2浓度(Ci)日变化呈不规则的“V”字型;⑶4个品种净光合速率日变化平均值大小排序为:‘葡萄桐’>‘小米桐’>‘对年桐’>‘大米桐’;⑷影响油桐净光合速率值的主要生态生理指标大小依次为：蒸腾速率>胞间CO2浓度>光合有效辐射>气孔导度。     

油桐乙酰辅酶A羧化酶BC亚基全长cDNA克隆及序列分析

以葡萄桐的近成熟种子为材料,根据油桐转录组测序结果设计引物,采用RT-PCR技术克隆了油桐乙酰辅酶A羧化酶BC亚基基因的全长c DN A序列。该基因c DNA序列全长1 605 bp,编码534个氨基酸。推导出的BC亚基氨基酸序列蛋白的等电点p I为7.98,相对分子量58 262.0 Da,稳定系数为38.13,生物信息学分析表明,此蛋白含有2个比较明显的跨膜区,是一个不稳定的非分泌蛋白。模体搜索结果表明在BC上具有ATP结合位点。三级结构中有16个α螺旋,3个部分形成一个内凹的结构。     

油桐种胚再生体系的建立

为了建立快速有效的油桐再生体系,以葡萄桐种胚为试材,研究了贮藏方式、消毒时间、培养基及培养条件对油桐种胚成苗的影响。结果表明:种子沙藏与在自然条件下贮藏对油桐种胚成苗的影响无明显差异;种胚的最佳消毒处理为0.1%的升汞浸泡3 min;将种胚接种在1/2MS+IAA 0.5 mg/L的培养基中成苗率最高,为98%;在培养基中加入6-BA易使种胚产生大量的愈伤组织,不利于油桐胚再生体系的建立;培养基的最适pH值为5.5;与遮光处理相比,光照能缩短种胚再生体系建立的周期。     

油茶脂氢过氧化物裂解酶基因的克隆与序列分析

以油茶近成熟种子为材料,根据油茶EST文库中已知的脂氢过氧化物裂解酶EST序列,利用3’RACE与5’RACE技术,克隆到脂氢过氧化物裂解酶的全长cDNA序列。该基因全长1648bp,,包含一个1476bp开放阅读框长,编码491个氨基酸,5’与3’非编码分别为52bp、121bp。预测该蛋白相对分子量为54.7779KDa,等电点为6.77,是个叶绿体转运肽,N端包含有22个疏水氨基酸残基组成的序列,不仅具有转运肽富含的丝氨酸,还含有大量转运肽中很少存在的脯氨酸。多序列比对发现油茶脂氢过氧化物裂解酶核苷酸序列与茶的相似性达到96%,因此将该基因命名coHPL。