共检猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的cDNA芯片的技术优化

【目的】对前期构建的猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和A型猪轮状病毒(PoRVA)共检cDNA芯片进行技术创新和关键参数优化。【方法】根据靶基因PEDV(S和M)、TGEV(N和S)以及PoRVA的(VP7和NSP4)分别设计6对特异性引物,扩增探针制备芯片阵列。重点改进了样品标记技术,引物直接标记与不对称PCR扩增结合,确定了不对称PCR扩增体系;并对点样缓冲液、水合时间、探针浓度、杂交时间和温度、清洗和干燥方式等条件进行优化。【结果】当博奥和百傲两种缓冲液比例为1∶1,水合时间为4 s,探针浓度为600 ng/μL,不对称PCR上下游引物比为1∶40,在48℃杂交3 h,用0.2%SDS清洗,1 000 r/min离心,该cDNA芯片效果最佳。【结论】本研究确定了PEDV-TGEV-GAR共检cDNA芯片的关键技术参数,为开展基因芯片的标准化制备和应用奠定了基础。     

猪传染性胃肠炎病毒SC-H株的分离与鉴定

猪传染性胃肠炎(TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)引起的猪的一种急性、高度接触性肠道传染病,临床症状主要表现为严重腹泻、呕吐和脱水.我国从20世纪60年代起就有TGE的报道,近些年来有进一步流行的趋势,尤其是冬季和早春寒冷季节常呈地方性流行,给养猪业造成了巨大的损失.     

一起鸡葡萄球菌和巴氏杆菌混合感染的诊治

<正>2008年7月份,乐山市某万只养鸡场约40日龄的肉鸡发生体表出血症,病鸡均在20~30日龄开始发病,已发病20天左右,发病数量约1 000只,每天死亡20~30只,已共计死亡500余只。主要症状为病鸡精神萎     

胸膜肺炎放线杆菌铁离子摄取的分子机理

<正>胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,App)是猪胸膜肺炎的病原,可引起各种年龄的猪发病[1]。目前,App有2个生物型和15个血清型:1型～12型、15型为生物I型,13型和14型为生物II型[2]。所有血清型均能引起猪发生胸膜肺炎,但生物II型比生物I型的毒力弱,有些血清型毒力明显更强[1,3]。App致病性强,可通过空气传播,各血清型之间交叉保护力低。因此,很难被有效控制,给养猪业造成了严重的经济损失。     

猪病毒性腹泻病金标银染可视化芯片技术实验条件优化研究及应用

基因芯片标准化是其特异灵敏检测病原的基本保障,本研究针对金标银染可视化基因芯片制备中点样缓冲液的使用、点样次数、杂交温度、杂交时间、胶体金浓度以及银染时间分别进行优化实验,分析其对金标银染可视化共检基因芯片杂交信号的影响.分别选取猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的S和M基因,猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis of swine virus,TGEV)的N和S基因,A型猪轮状病毒(Group A porcine rotavirus,GAR)的VP7和NSP4基因设计引物.根据目的基因片段设计5’端修饰有15个T碱基的60-mer寡核苷酸探针,分别以1∶1混合点样缓冲液和直接进行喷样两种方式,利用芯片点样仪喷样分别喷样1次、2次、3次于醛基玻片上制成基因芯片.应用不对称PCR对实验室构建保存的三种腹泻病毒的阳性质粒进行生物素掺入标记,分别在40、45、50和55℃与基因芯片杂交30、60、90和120 min.利用生物素-链霉亲和素的特异性链接,分别将稀释10、20、30、40、50及60倍的链霉亲和素修饰的纳米金颗粒引入反应体系,通过不同银离子染色时间后后,直接眼观实验结果.应用优化后的标准化可视化芯片和RT-PCR同时对173份临床送检病料进行检测,以评价芯片临床应用.结果表明,应用探针和点样缓冲液1∶1混合的方法进行1次喷样制作的基因芯片,在50℃环境中杂交90 min后,与4μg/mL链霉亲和素修饰的纳米金颗粒结合,再进行12～14 min银染,经过10次重复性实验,可确定为金标银染可视化基因芯片的最佳优化条件.临床病料可视化芯片检测结果与RT-PCR检测结果一致.本研究确定了病毒性腹泻可视化共检芯片的最佳反应条件,为该技术的临床应用标准化研究奠定了基础.     

口蹄疫病毒O、A和AsiaⅠ型分型基因芯片的构建与评价

口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的一种高度接触传染性动物疫病。本研究拟建立一种能区分FMDV O/A/AsiaⅠ型的基因芯片。根据FMDV O/A/AsiaⅠ型的VP1基因序列设计3对特异性引物,用RT-PCR扩增获得248、206和239 bp的三个靶基因片段,并针对这三个片段分别设计了3种探针,以引物荧光标记法标记靶基因,建立了一种鉴别FMDV O/A/AsiaⅠ型的分型基因芯片并进行了敏感性、特异性、重复性和保存期评价。结果表明最佳反应条件为:水化温度37℃,封闭液为0.25%BH_4Na/25%乙醇,杂交温度为42℃。灵敏性实验表明,FMDV-O检测限为118 pg/mL,FMDV-A为18.4 pg/mL,FMDV-AsiaⅠ为129 pg/mL,芯片方法灵敏度比常规RT-PCR高10~100倍;特异性实验表明,O、A和AsiaⅠ三型之间无交叉杂交;该芯片可至少保存3个月仍能重复使用。本研究建立的FMDV分型基因芯片为O、A和AsiaⅠ型鉴别提供了新方法。     

猪传染性胃肠炎病毒N基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

应用RT-PCR扩增猪传染性胃肠炎病毒SC-H株N基因,将扩增的N基因克隆到pMD18-T载体中,进行BamHⅠ和SalⅠ双酶切鉴定,将获得的N基因片段以pET32a（＋）载体进行亚克隆,构建了pET32-N重组表达质粒并进行鉴定。将pET32-N重组质粒转化BL21（DE3）大肠杆菌中进行表达,并对表达条件进行了选择,对表达产物进行了定位和纯化。结果表明,N基因全长1149 bp,编码382个氨基酸,克隆的N基因包含完整的阅读框且能在大肠杆菌中正确表达,表达的最佳IPTG诱导浓度为0.8 mmol/L,最佳诱导时间为3 h,表达的N蛋白约为47 000,主要以包涵体形式存在于细胞质中。     

真核双顺反子表达载体pcDNA3.1AB的构建与表达

为了构建由双CMV启动子调控的真核双顺反子表达载体pcDNA3.1AB,首先在pcDNA3.1(+)的基础上,构建出pcDNA3.1A和pcDNA3.1B,通过PCR扩增pcDNA3.1A上含-PCMV-MCS-BGHpolyA-表达单元的片段,定向克隆入pcDNA3.1B,即得载体pcDNA3.1AB。将DsRed与EGFP基因插入pcDNA3.1AB,分别构建pcDNA-DsRed、pcDNA-EGFP和pcDNA-DsRed-EGFP。质粒转染COS-7细胞瞬时表达,用荧光显微镜进行检测。结果双价质粒pcDNA-DsRed-EGFP能同时表达红色和绿色荧光蛋白基因,两基因表达强度无显著差异,且双价与单价质粒相比荧光蛋白表达强度相当。双顺反子表达载体pcDNA3.1AB的成功构建和表达,为进行基因表达及双价核酸疫苗的研究奠定了基础。     

高乳化性蛋黄粉生产技术

近年来,干蛋品工业有了很大的发展,在众多的干蛋品中,蛋黄粉是其中的重要组成部分.蛋黄粉主要含有30%左右的蛋白质和38%左右的甘油酯以及19%左右的磷脂,还有少量的糖类、矿物质、维生素、色素、酶等.……     

模拟氮沉降对南亚热带旱冬瓜幼苗生长性状及枝叶构建影响

选择云南省南亚热带地区常见的用材树种旱冬瓜幼苗,设置4种模拟氮沉降水平(5、10、15、30g·m~(-2)·a~(-1))以及1组对照控制试验,研究模拟氮沉降增加对其生长效应和枝叶的大小与数量关系的影响。结果表明:与对照处理组的旱冬瓜幼苗株高和地径比较,在低氮水平处理(5g·m-2·a~(-1))下极大促进了幼苗的生长,而中氮(15g·m~(-2)·a~(-1))和高氮(30g·m~(-2)·a~(-1))水平处理组的旱冬瓜幼苗生长逐渐受到抑制,原因是由于氮输入的增加以及旱冬瓜的根瘤菌具有明显的固氮作用。同时,经过12个月的处理,旱冬瓜幼苗的全株生物量随氮沉降处理水平的增加而降低,而叶重比、根重比和根冠比则呈增加趋势,氮沉降的输入改变了不同器官在全株生物量的分配。模拟氮沉降的不同处理水平影响了旱冬瓜幼苗的枝叶构建特征,表现为茎截面积、总叶面积、枝长度和叶片数也随氮沉降处理的增加而降低,高氮处理下的旱冬瓜在较小的单位茎截面积上会支撑更多的叶面积,在较小的枝长度可以支撑较多的叶片数。