水稻锌指蛋白基因CRISPR/Cas9突变体的构建及突变分析

[目的]通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对水稻锌指蛋白基因(OsC3H54)进行基因编辑,筛选鉴定出其突变体植株,为深入研究OsC3H54的生物学功能提供良好材料,也为水稻锌指蛋白研究提供参考依据.[方法]通过E-CRISP在OsC3H54基因的外显子上设计靶点序列,将靶点序列连接至OsU6SK载体上,再与Cas9一起连接到pCAM-BIA1300双元载体上,获得CRISPR/Cas9重组双元载体,通过农杆菌介导将其转入日本晴水稻愈伤组织,利用潮霉素进行抗性筛选,获得突变体植株,并分析其靶点位置的碱基及编码氨基酸突变情况.[结果]在OsC3H54基因第2个外显子上找到2个符合靶点设计要求的靶点,分别为TG1:5'-CCGCCGCGGCTGCCTTTGGATAC-3'和TG2:5'-CCTTCCC CAATGGCGGGGGTGGC-3'.将OsU6SK载体和靶点序列正确连接的重组载体与Cas9一起连接至pCAMBIA1300双载体上,成功获得CRISPR/Cas9重组双元载体(pCAMBIA1300-Cas9-TG1和pCAMBIA1300-Cas9-TG2).通过农杆菌介导转入日本晴水稻,经潮霉素抗性筛选获得TG1靶点株系和TG2靶点株系,共16株CRISPR/Cas9突变体植株.CRISPR/Cas9突变体植株在靶点序列的突变位点位置附近出现套峰,表明2个株系的植株均发生碱基突变,其中Y1、Y2、Y3和Y4突变体植株均为单碱基插入突变,最终导致编码的氨基酸发生移码突变,蛋白翻译提前终止.[结论]水稻OsC3H54基因CRISPR/Cas9突变体植株的获得为进一步研究水稻锌指蛋白生物学功能提供了良好材料.     

苜蓿、小麦自毒及他感作用机理

通过苜蓿(Medicago sativa)和小麦(Triticum aestivum)幼苗植株浸提液种内浇灌和种间浇灌培养生长,研究了苜蓿、小麦自毒和他感效应。结果表明,浸提液种内浇灌,浓度大于0.1 g·L~(-1),随着浸提液浓度的增加自毒效应增强;浸提液种间浇灌,浓度为0.1、0.25、0.5 g·L~(-1)时,苜蓿小麦间存在他感正效应,其中0.25 g·L~(-1)的浸提液他感正效应最强,且小麦浸提液对苜蓿的他感正效应较苜蓿浸提液对小麦的他感正效应更大;浓度达1 g·L~(-1)时,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性改变为持续降低,导致丙二醛(MDA)、过氧化氢(H_2O_2)含量增加,相对膜透性增强,活性氧有效积累,生命系统维持遭到破坏,抑制生长,苜蓿小麦间表现为他感负效应。苜蓿、小麦自毒效应会随着浸提液浓度的增大而增强。苜蓿、小麦他感效应表现出低促高抑的浸提液浓度效应。     

产油微生物的筛选及其产油率测定

为寻求可再生、环境友好且经济可行的化石能源替代燃料,采用苏丹黑B和尼罗红染色法及甲醇-氯仿提取法对平顶山各地不同生境富含油脂土壤中的高产油脂微生物进行分离筛选。结果表明:试验分离到2株产油菌株PDS1和PDS2。其中,产油细菌PDS1为革兰氏阴性菌,产油率为29.47%;产油细菌PDS2为革兰氏阳性菌,产油率为23.57%。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒的分子鉴定及葫芦科不同品种对其抗性评价

黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)在世界范围内对葫芦科作物造成严重危害,其危害症状因寄主而异,包括严重花叶、变色及畸形。运用RT-PCR技术,对黄瓜绿斑驳花叶病毒进行分子鉴定,并与其他CGMMV分离物进行系统发育分析。同时,以14个不同的葫芦科品种为试材,在苗期人工摩擦接种CGMMV,通过Dot-ELISA技术对接毒幼苗进行带毒率检测。结果表明,本实验(浙江杭州)CGMMV分离物与我国其他省份(海南、广东、辽宁、安徽)及韩国的分离物亲缘关系较近,相似度为99.9%~100%,与来自中国浙江杭州地区(建德、萧山)、江苏、山东的分离物相似度为99.5%~99.6%,与俄罗斯、美国的分离物亲缘关系较远,相似度在95.3%~95.4%之间,表明本实验分离物可能与同源性较高的其他地区的分离物具有相同的侵染来源。抗性评价结果显示,在西瓜的9个品种中,浙蜜二号、丰乐五号为中度抗病,而最易感病的品种是抗病京欣,为中度感病;而在其他瓜类品种中,黄瓜津优一号和津绿一号为中度抗病;蒲瓜浙蒲六号和青蒲一号分别表现为低度感病和中度感病;瓠瓜圆瓠一号表现为低度感病。     

一株溶藻真菌的初步分离鉴定及其溶藻作用研究

从水体中分离得到一株具有溶藻能力的真菌,命名为Am11.经形态学和18S rRNA序列对比分析,表明该菌株属于赤霉菌属(Gibberella).研究了该菌株对湖泊中优势藻的溶藻效果,初步探讨了其溶藻方式及溶藻物质.结果表明,该菌株对小球藻、惠氏微囊藻、栅藻和蛋白核小球藻具有一定的去除效果,对4种藻叶绿素a的去除率分别为82.5％、64.9％、63.5％和85.4％;该菌株对蛋白核小球藻是间接溶藻,且溶藻因子是菌体胞外分泌的具有热稳定性的非蛋白类物质.     

超声波-酶协同提取西藏猫乳总黄酮工艺及抗氧化活性

以西藏猫乳茎枝为试材，采用超声波-酶协同法提取其中的总黄酮，通过单因素试验与响应面设计法对提取工艺进行优化，得到最佳工艺参数。在该基础上，将超声波-酶协同法与超声波法、酶解法进行比较，考察其抗氧化活性，以期为西藏猫乳的进一步开发利用提供参考依据。结果表明：超声波-酶协同提取西藏猫乳总黄酮最优条件为纤维素酶浓度0.31 mg·mL^-1、乙醇浓度53%、酶解pH 5.0、酶解时间2 h、酶解温度50℃、超声温度50℃、液料比40∶1 mL·g^-1、超声时间30 min,在该条件下，总黄酮提取量为17.01 mg·g^-1,提取工艺稳定可靠。与超声波法和酶解法比较，超声波-酶协同提取总黄酮含量较高，且具有更好的DPPH·和ABTS⁺·清除能力。