鸡传染性支气管炎病毒S1基因的原核表达及生物活性分析

[目的]研究鸡传染性支气管炎病毒S1基因的原核表达及反应原性鉴定。[方法]将S1基因克隆到pMD18-T质粒载体上构建pMD18-T-IBV-S1载体;将目的基因插入原核表达载体pET-32a（＋）的多克隆位点区,并将构建的重组质粒转化至宿主菌BL21中;IPTG诱导后的蛋白做SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析。[结果]S1基因在大肠杆菌中成功地进行了表达,表达的融合蛋白约为66kD,以包涵体形式存在。免疫印迹试验显示,重组蛋白可被IBV多克隆抗体识别。[结论]S1重组蛋白具有反应原性,为进一步研究IBV的新型疫苗奠定了基础。     

传染性法氏囊病病毒Vero细胞培养条件优化的研究

鸡传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）在Ｖｅｒｏ细胞上增殖条件的优化研究结果表明，ＩＢＤＶ在Ｖｅｒｏ细胞上敏感性有所提高；降低轿清含量，中性ｐＨ环境，适当高的细胞密度有利于ＩＢＤＶ的增殖。     

副猪嗜血杆菌分离株耐药性、血清型及RAPD基因型分析

为弄清某规模化养猪场感染和流行的副猪嗜血杆菌(HPS)菌株的耐药性、血清型及基因型,本试验自该猪场发生浆膜炎和关节炎病猪的不同组织样品中分离到6株HPS菌株,通过细菌培养特性、生化试验和PCR扩增细菌16S rRNA基因片段并测序对分离株进行鉴定;进而鉴定分离株对不同类别抗生素的耐药性;最后对分离株进行血清分型和RAPD基因分型并分析两者的相关性。结果显示,自病猪不同组织脏器中分离鉴定了6株HPS菌株,体外培养具有典型卫星生长现象;生化试验结果符合HPS反应特性;PCR均可扩增出821 bp的HPS 16S rRNA基因片段,且序列与HPS一致。药敏试验结果显示分离株对头孢菌素类、青霉素类、氨基糖苷类、大环内酯类和四环素类抗生素敏感,而对喹诺酮类、磺胺类、林可霉素类和氯霉素类抗生素产生耐药性。琼脂扩散试验结果显示HPS分离株均为血清5型;RAPD分析显示HPS分离株与15个血清型参考菌株可分为4个基因型。本试验结果为HPS的流行病学调查及防控具有一定的借鉴价值。     

鸡传染性法氏囊病Vero细胞罐培疫苗的安全性和免疫效力研究

使用SPF和百免疫雏鸡分别对连续3批鸡传染性法氏囊病Vero细胞罐培疫进行了安全试验和效力试验。10倍剂量接种7日龄SPF雏鸡和16日龄非免疫雏鸡，在21d观察期中，接种鸡均无任何传染性法氏囊病的特征特性症状出现，健康存活，剖杀观察无异常，平均囊脂数为0.76以上。1/5剂量免疫7日龄SPF雏鸡和16日龄非免疫雏鸡，14d后中和抗体达371.5(GMT）以上，21d时中和抗体为977.2以上，攻击标准I型强毒GJ801F15代囊毒的保护率为90%以上。结果表明，该疫苗安全有效，也说明Vero细胞罐培工艺切实可行。     

共表达鸡传染性法氏囊病毒VP2基因和鸡补体因子C3d基因的真核表达质粒的构建

传染性法氏囊病（Infectious bursal disease，IBD）是一种由鸡传染性法氏囊病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）引起的危害3～12周龄青年鸡的急性、高度接触性传染病。由于IBDV主要侵害鸡的淋巴器官法氏囊而引起严重的B细胞免疫应答抑制，使病鸡对其他疾病的易感性增加及对其他疫苗免疫的应答能力下降，因此给养禽业造成巨大的损失。     

副猪嗜血杆菌PCR诊断试剂盒的研制及初步应用

在特异性和敏感性试验的基础上,组装副猪嗜血杆菌PCR诊断试剂盒,进行批间和批内试剂盒的检测、试剂盒在不同温度条件下的保存期试验等.结果表明,试剂盒特异性好、敏感性高,批内和批间的试剂盒无差异,试剂盒在-20℃可保存30个月,4℃可保存12个月.适用于不同地区、不同条件的实验室快速检测副猪嗜血杆菌.     

副鸡禽杆菌外膜囊泡提取及成分分析

为研究副鸡禽杆菌外膜囊泡(OMVs)的构成,提取A型副鸡禽杆菌的OMVs,纯化并透射电镜观察其形态结构,检测其内毒素含量和DNA含量,分析其是否具有血凝活性,测定OMVs蛋白含量,并用质谱法分析了OMVs的蛋白组成成分。结果显示,副鸡禽杆菌的OMVs呈球形、泡状,直径为20 nm～300 nm,含有内毒素和少量核酸物质。该OMVs不能凝集鸡红细胞,Western blot结果表明,OMVs蛋白与该菌外膜蛋白单克隆抗体有阳性反应,构成OMVs的蛋白分子质量大多集中于65 ku和13 ku处,蛋白成分主要有ATP依赖性RNA解旋酶等多种功能酶、铁链霉素B受体、膜蛋白等结构成分和一些未知功能的假定蛋白等,为进一步分析副鸡禽杆菌外膜囊泡在致病和免疫方面的作用奠定基础。     

副鸡禽杆菌LAMP检测方法的建立

应用环介导等温扩增(LAMP)技术建立了快速特异的检测副鸡禽杆菌的方法。利用在线引物设计软件Primer Explorer Version 4.0,针对副鸡禽杆菌16SRNA基因序列设计两组LAMP引物,并对副鸡禽杆菌特异性DNA的扩增条件进行优化,评价所建立LAMP的特异性和灵敏性。结果显示,优化后的反应条件为65℃恒温反应60min,内引物1.60pmol/μL、外引物0.20pmol/μL。该LAMP对13株副鸡禽杆菌均发生了扩增反应,而对大肠埃希菌、禽多杀性巴氏杆菌、空肠弯曲杆菌等14株其他病原微生物没有扩增反应;该LAMP最低检出量为0.17pg/反应,敏感性远高于常规PCR的56pg/反应。结果表明,所建立的副鸡禽杆菌LAMP具有快速、高效、方便操作等特点,适用于基层兽医部门进行副鸡禽杆菌的快速检测。     

溶血性曼氏杆菌的分离鉴定

溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica)原名溶血性巴氏杆菌(Pasteurella haemolytica),是巴氏杆菌属的一个新成员.该菌是绵羊肺炎、新生羔羊急性败血症的病原菌,还可以导致牛的呼吸道疾病、羊的呼吸道疾病和败血症,也是牛的运输热、圈舍热的主要致病菌.     

副猪嗜血杆菌外膜蛋白OmpP2基因的克隆及表达

为了获得副猪嗜血杆菌外膜蛋白OmpP2分泌性蛋白分子,克隆了该蛋白编码序列,约1 081bp,成功构建pET28a-OmpP2原核表达质粒,并将其转化到大肠埃希菌BL21(DE3)菌株.经0.4 mmol/L终浓度IPTG、32℃诱导5 h后,目的蛋白表达量最高.Western blot检测表明,该蛋白与副猪嗜血杆菌阳性血清发生特异性反应,说明该蛋白有良好的反应原性,为今后研究OmpP2的生物学特性及对HPS的血清学诊断、亚单位疫苗的开发奠定了基础.