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从水貂脑垂体中分离提取总RNA,经过RT—PCR分别扩增出水貂生长激素前体肽和成熟肽cDNA。PCR产物经凝胶回收纯化,克隆到栽体pGEM—T,然后转化感受态细胞DH5α。在含X—gal、IPTG的LB(Amp^ )平板上筛选阳性克隆,提取质粒作限制性酶切鉴定后,对目的片段进行测序。结果表明,RT—PCR扩增出的2个cDNA片段碱基数分别为713bp和780bp,用DNAsis2.5软件进行分析表明,此扩增序列与GenBank中发表的水貂生长激素cDNA100%相同。前体肽编码区由651bp组成,编码216个氨基酸,包括长度为29个氨基酸的信号肽;成熟肽的开放阅读框全长564bp,编码187个氨基酸,分子量约为21kDa。通过Blast比对,分析了与人、马、牛、猪、山羊、绵羊、猫、狗、大鼠和小鼠生长激素核苷酸序列的同源性。 相似文献
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本研究旨在建立水貂生长激素(mink growth hormone,mGH)的原核高效表达体系,探索mGH蛋白规模化生产方法,利用获得的目的蛋白制备特异抗血清。将已构建的原核表达载体pET28b-mGH转化大肠杆菌Rosetta(DE3)TM pLysS感受态细胞,经IPTG诱导表达,超声破碎菌体后离心获得包涵体蛋白,利用8 mol/L尿素对其进行溶解和复性,经Ni-NTA树脂亲和层析纯化获得重组蛋白。通过Western blotting检测及MALDI-TOF-MS质谱分析对获得的蛋白进行鉴定。用SDS-PAGE电泳法检测蛋白纯度,用BCA法测定其浓度。复性mGH蛋白与完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂乳化制备免疫抗原,采用皮下多点注射法免疫3只新西兰大白兔,首次免疫剂量为600 μg/只,二免剂量为600 μg/只,三免剂量为400 μg/只。三免10 d后分离制备血清,Western blotting法检测其特异性,间接ELISA法检测其效价。结果表明,原核表达的包涵体经Ni-NTA柱纯化后所得蛋白鉴定为mGH融合蛋白;SDS-PAGE电泳鉴定复性mGH蛋白条带单一,纯度达90%以上,BCA法计算蛋白浓度为669 μg/mL,均达到了免疫动物的要求;制备的抗血清经Western blotting检测具有良好的结合特异性,间接ELISA法测定其抗体效价达1:256 000以上。上述结果表明,原核表达载体pET28b-mGH可在大肠杆菌Rosetta(DE3)TM pLysS细胞中高效表达mGH融合蛋白,表达蛋白经变性、复性和纯化后免疫新西兰大白兔,可制备高效价特异性抗血清。 相似文献
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枣树开甲是枣树丰产的重要措施之一。开甲后,甲口难以完全愈合则是目前生产中普遍存在的现象。对甲口不愈现象的成因、防治方法及防治效果予以探讨并作以介绍,旨在为枣树丰产提供经验和措施。 相似文献
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以转基因处理的家蝇卵为对象,采用银染差异显示技术(DDPCR).对携带绿色荧光蛋白(GFP)和抗菌肽(ABP)融合基因的真核表达质粒以电转移的方式进入家蝇受精卵后,卵内基因的表达情况做了初步研究。结果表明,转基因处理的蝇卵与未经转基因处理的蝇卵在分化开始之前基因的表达存在差异;以T11MA为锚定引物,在转基因处理组发现6条差异表达的片段,成功地克隆得到其中3夸。序列分析证实其中2条为新基因片段,另1条为家蝇细胞色素C的编码片段;斑点杂交证实了新基因片段仅在转基因处理组得到表达,而细胞色素C在2组中都有表达。获得的新基因片段登录于GenBank,登录号分别为AY030235和AY030236。本试验结果为解释外源基因在宿主细胞内的去向.发现宿主内部对目的基因整合和分解的相关因素提供了可能,并为系统地开展发育相关研究打下了基础。 相似文献
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非典型肺炎冠状病毒与其他动物冠状病毒的亲缘关系 总被引:1,自引:0,他引:1
非典型肺炎即重症急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndromes,SARS),其病原目前被普遍认为是一种冠状病毒。本试验利用分子生物学计算机软件,首先对已在GenBank中发表的17株SARS病毒的主要结构蛋白基因S、M、N进行了定位,然后分别与已发表的其他冠状病毒的S、M、N基因进行同源性分析。结果发现,我国内地的5个SARS毒株的主要结构蛋白基因与其他冠状病毒的相对应基因的同源性普遍较低,而且变化范围较大。香港及国外的SARS毒株的情况恰好相反。从总体上看,SARS病毒与已发表的其他冠状病毒的亲源关系均较远,相对而言,与牛冠状病毒(BCV)、小鼠肝炎冠状病毒(MHV)的亲缘关系最近。这一结果对于SARS病毒的起源及流行病学研究乃至该病的预防和控制研究具有一定的参考价值。 相似文献