HRP-SPA ELISA检测猪日本乙型脑炎病毒抗体的研究

将盐析法提纯的、用Hela细胞系增殖的猪日本乙型脑炎病毒JapaneseBencephalitis(JEV)抗原包被酶标板,以HRP-SPA作为第二抗体,建立了检测JEV抗体的ELISA试验方法。结果表明,抗原的最适包被浓度为1∶800,待检血清最适稀释度为1∶50,HRP-SPA最佳工作浓度为1∶1000,各步反应时间确定为5min。交叉试验、阻断试验、重复性试验、敏感性试验证明本实验特异性强,重复性好,敏感性高。包被的病毒抗原经甲醛固定15min即可进行正式试验。确定其测定标准为:S/N≥14.81为阳性,S/N<12.53为阴性,12.53≤S/N<14.81为可疑。     

猪生殖与呼吸综合征病毒HN6株ORF5基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

用RT—PCR方法从河南分离的1株（HN6）猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）核酸中扩增缺失N端疏水序列的基因片段dORF5（deleting ORF5），并将其克隆到pMD18-T载体中测序，再亚克隆到原核表达载体pET-32a上。重组质粒转化大肠杆菌BL21，用不同浓度IPTG分别于37℃诱导，经SDS—PAGE分析，所表达的融合蛋白的分子质量约31．4ku，薄层扫描分析显示，表达量占菌体总蛋白含量的28．8％。Western—blotting结果表明，重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别。证实，该蛋白可用于PRRSV的诊断。     

某发病猪场链球菌的分离鉴定及药敏试验

猪链球菌是一种能感染人和动物的常见病原菌。本实验从山东省某猪场病死猪中分离出两株细菌;通过培养特性观察,革兰染色镜检,特异性基因扩增等一系列分析,确定其为链球菌;进一步进行PCR分型检测,确定其中一株属马链球菌兽疫亚种,另一株为猪链球菌7型。通过药敏试验发现,这两株菌对约95%的常用药物表现出耐药性,仅对链霉素、氯霉素、万古霉素和呋喃妥因较为敏感。     

辽宁省部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒流行株ORF5-7基因遗传变异分析

根据GenBank发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ATCC VR-2332全基因序列,设计并合成2对引物,采用RT-PCR技术,对辽宁省站送检的病料进行分离扩增,分别获得相应的目的片段,将其分别克隆入pMD18-T载体中,并送上海生工测序。应用DNAStar软件分析所测序列,并与ATCC VR-2332、CH-1a、BJ-4、LV-M96262及疫苗株的ORF567基因进行序列比较,通过核苷酸序列分析表明这5株流行株与VR-2332、CH-1a、BJ-4等代表株的同源性为89.5%～95%,与LV-M96262的同源性为54%～58.3%.氨基酸序列分析表明这5株流行株与VR-2332、CH-1a、BJ-4等代表株的同源性为82.8%～94.7%.     

一起猪蓝耳病与伪狂犬病混合感染的紧急流行病学调查

2017年11月4日起,山东省某猪场部分育肥猪出现咳嗽、气喘、发烧等症状,发病6~7 d后死亡。随后,个别母猪发生流产,哺乳仔猪、保育猪接连出现呼吸道症状并死亡。为探寻可能的发病原因,以便及时提出并采取行之有效的防控措施,开展了紧急流行病学调查。通过现场调查、临床诊断与实验室检测,确定本次疫情系猪蓝耳病病毒与伪狂犬病病毒混合感染所致。调查发现:邻场发病、人员传播、寒冷应激、断奶应激均可能是诱发此次疫情的原因。针对此次疫情,提出全群紧急免疫伪狂犬病疫苗,并配合使用长效土霉素与抗生素进行治疗等建议。养殖户采纳了建议并采取了相应措施,最终疫情得到有效控制。     

PRV SD株gE基因主要抗原区域原核表达及间接ELISA方法的建立

参考猪伪狂犬病病毒(PRV)SD株g E基因序列,设计1对引物,通过PCR方法扩增一段包含g E主要抗原表位编码区的618 bp片段,将其用Bam HⅠ和Xho L I双酶切后,插入到原核表达载体pET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),进行表达、SDS-PAGE电泳、Western-blot检测和纯化;利用表达的PRV SD g E蛋白进行g E-ELISA鉴别检测方法研究。结果发现:gE重组蛋白得到了高效表达,融合蛋白的分子量约为42ku;表达产物存在于上清液中,表达量可达菌体总蛋白的30%以上,并且能被PRV抗体所识别。将纯化后的g E蛋白作为抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗猪Ig G为二抗,建立检测PRV抗体的间接ELISA方法。结果显示:确定的抗原最佳包被浓度为36μg/m L,最佳包被时间为37℃、1 h并4℃过夜,待检血清(1:50稀释)37℃作用1 h,二抗(1:3 000)37℃作用1 h。重复性试验、交叉试验证明该方法重复性好、特异性强、灵敏度高。用g E-ELISA和IDEXX g E-ELISA同时对采集的92份猪血清进行平行检测,发现该方法的特异性为85.71%,敏感性为90.63%,二者符合率为89.13%。该方法为我国猪伪狂犬病的鉴别监测提供了一种可供选择的技术手段。     

现代科技在我国主要动物疫病防控工作中的应用

目的分析现代科技对动物疫病防控工作的作用。方法综述了现代高新科技在生物技术与信息技术等多方面的进展,及其在主要动物疫病防控领域的最新应用。探讨了加强重大动物疫病防控的可能途径,以促进畜牧业经济快速、稳定、健康发展。结论随着现代科技的日新月异,将近一步促进我国动物疫病防疫工作的发展。     

猪流行性腹泻病毒变异株的鉴定和分子特征分析

为查明山东省某猪场流行性腹泻的病因,本研究对该猪场病死仔猪进行病理学检查,并对采集的7份仔猪腹泻样品进行猪流行性腹泻病毒(PEDV)的套式RT-PCR检测。病理学检查发现病猪的肠道肿胀、变薄、出血,肠绒毛皱缩、变短、边缘粗糙。套式RT-PCR结果显示,7份样品均为PEDV阳性;对其中两份PEDV阳性病料进行S基因扩增,分析其遗传变异,结果显示这两株PEDV野毒株的S基因与参考疫苗株CV777的同源性为92.3%~92.4%,与其他野毒株的同源性为96.6%~98.6%。PEDV的遗传进化树结果显示,PEDV分为两个进化分支G1和G2,G1包括CV777等疫苗株及中国和韩国早期的部分毒株,G2则是PEDV变异株为主的分支,包括本试验分离的野毒株及近年来美国、中国等国的野毒株,这些毒株都存在两个插入突变和1个缺失突变。结果表明,变异株已成为PEDV的流行优势毒株,且这些变异位点有可能成为鉴定PEDV变异株的分子特征。     

我国部分省份猪流行性腹泻的流行病学监测

[目的]为摸清我国猪群流行性腹泻的感染状况,[方法]从2011年底到2014年3月,对云南、广西等29个省份开展了猪群腹泻疫情流行病学调查,采集、收集了发生腹泻症状的发病猪群样品（新鲜粪便、肠道组织等）,进行了猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）等多种病原检测。[结果]在7021个调查猪场中,出现腹泻的阳性猪场4060个（57.83%）。在收集的1383份腹泻样品中,利用RT-PCR方法检测到PEDV阳性样本686份（49.58%）,其中腹泻发病猪样品中PEDV的检出率为67.82%,675份组织样品共检测出PEDV阳性样本86份（12.75%）。[结论]这表明我国猪场PEDV的感染十分普遍。对S基因进行分子流行病学分析发现,我国PEDV流行毒株与已有PEDV毒株可以分为2个完全不同的进化分支G1和G2,G1以CV777和DR13等疫苗株和早期毒株为主,G2则以2011-2013年流行毒株为主,流行毒株之间的同源性为97.8%-100%,与疫苗株CV777之间的同源性为94.3%-94.5%。     

猪伪狂犬病病毒PCR检测方法的建立与应用

参考GenBank中收录的猪伪狂犬病病毒gE基因序列,应用Primer5.0软件设计了一对引物,扩增目的片段为632 bp.进行PCR检测方法的特异性、敏感性、重复性及符合性试验,建立了PRV的PCR检测方法.应用该方法对临床疑似发病样品进行了检测,PRV检出率为14.6%.表明该方法具有快速、特异、敏感、重复性好等优点,可用于PRV的临床发病诊断及流行病学监测等.