基于1H NMR技术的乳热奶牛血清代谢组学分析

【目的】应用¹H谱核磁共振（¹H NMR）技术筛选乳热奶牛血清内差异表现的小分子代谢物,从小分子水平和物质、能量代谢的角度探究奶牛发生乳热时其体内的代谢变化。【方法】选取年龄、胎次、体况和泌乳量相近的分娩当天的荷斯坦高产奶牛共32头,根据其血清中钙离子浓度及其有无临床症状分为两组。其中,24头奶牛为健康对照组（Group1, 血钙浓度 > 2.5 mmol·L^-1,无其他任何症状）和8头乳热组（Group2, 血钙浓度 < 1.4 mmol·L^-1,伴有明显乳热临床症状）。32头奶牛分别于清晨饲喂和榨乳前从颈静脉采集血液10 mL,置于离心管中,4℃下以1 500 × g 离心20 min,将离心得到的血清装入1.5 mL的EP管中,置于-80℃下待测。待样品解冻后,分别从每个EP管中抽取400 μL血清,加入200 μL缓冲盐溶液,充分混合、离心后,提取550 μL上清液置于5 mm核磁管中,在500 MHz的核磁共振波谱仪下采集信号。然后利用Topspin和MestReNova等软件将采集到的信号进行傅里叶转换,同时进行调零、校正基线和相位等预处理,去除水峰和尿素峰信号,将一维图谱进行积分分段,并将图谱信息转换为TXT格式文件,以便于后续数据分析,然后使用Chenomx软件进行化合物指认。最后应用SIMCA-P软件对得到的图谱数据进行多元统计分析,包括主成分分析（PCA）和正交修正-偏最小二乘法-判别分析（OSC-PLS-DA）, 同时结合SPSS软件对核磁数据进行单因素方差分析得到的P值以及Loading图,最终筛选出表现差异的小分子代谢物。【结果】本试验成功得到了乳热组和健康对照组奶牛的血清代谢图谱及差异表达代谢物的Loading图;PCA结果显示每组样品均在95%置信区间内,无需剔除,主成分贡献率较低,其中PC1=26.2%,PC2=16.7%,组间差异变量不能被选择;OSC-PLS- DA结果显示经过5次正交信号修正,与分组无关的变量被去除,组间差异达到最大化;与健康对照组相比,共筛选出9种血清差异表达代谢物,其中4种表达上调,分别为 β-羟基丁酸、丙酮、丙酮酸和赖氨酸,5种表达下调,分别为葡萄糖、丙氨酸、丙三醇（甘油）、磷酸肌酸和氨基丁酸;9种差异代谢产物多为糖和氨基酸,相互之间形成了一个能量转化网络图,通过多种代谢途径参与了机体能量代谢过程,其中较为特殊的差异代谢产物,如磷酸肌酸可直接为机体提供能量,其表现降低可能与病牛肌无力和瘫痪有关。此外,本试验中乳热组奶牛氨基丁酸降低,临床表现为精神沉郁、甚至昏迷,这与人类抑郁症患者的氨基丁酸表现相吻合,有关氨基丁酸下降与奶牛乳热精神的关系有待研究者进一步证实。【结论】¹H NMR技术能够被应用于筛选奶牛血清表现差异的小分子代谢物,代谢物差异显著;本试验中乳热奶牛血清差异代谢产物表现出能量负平衡及脂肪动员的病理学特征,提示乳热与能量代谢障碍有关。     

过瘤胃葡萄糖对泌乳早期奶牛产奶量和乳汁成分的影响

选取产后10～15d,年龄、胎次、产奶量相近,年产奶量大于6t的荷斯坦奶牛24头,随机分为4组,每组各6头.Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别在基础日粮中每头每天添加200,300和400g过瘤胃葡萄糖,Ⅳ组为对照组,饲喂基础日粮.过瘤胃葡萄糖分早、晚2次混于精料中,任其自由采食,饲喂期20d.通过对试验奶牛在饲喂前、饲喂后10d和20d的产奶量、乳汁成分的分析.结果显示,与对照组比较,Ⅰ组产奶量极显著升高(P<0.01);乳脂肪、乳蛋白、乳糖水平均不显著(P>0.05).表明过瘤胃葡萄糖能提高奶牛泌乳性能.     

瘦素与奶牛泌乳早期能量平衡和生殖机能的关系

为阐明奶牛血浆瘦素、能量状况和生殖机能之间的关系,随机选取年龄、胎次、泌乳量相近的奶牛60头,分别在产后1、14、28、42、56和70 d时颈静脉采血,根据血糖浓度在6个时间点分为低血糖组(L)和对照组(CK).同时调查和检测奶牛的生产性能(体重、泌乳量和干物质摄入量)、繁殖性能(首次配种间隔、情期受胎率、发情率和配种指数)、血液生化指标(血糖、β-羟丁酸和游离脂肪酸)和内分泌指标(胰岛素、胰高血糖素、瘦素、雌二醇和孕酮).结果显示:奶牛泌乳早期存在不同程度的能量负平衡,产后14 d最高.能量负平衡(negative energy balance,NEB)能使奶牛产后干物质摄入量(DMI)、体重(BW)和泌乳量(MY)减少,首次配种间隔延长,情期受胎率和发情率降低,配种指数增高,血浆胰岛素(Ins)、胰高血糖素(Gn)、瘦素(leptin)、雌二醇(E2)和孕酮(P4)浓度降低,呈现低血糖(Glu)、高血浆游离脂肪酸(NEFA)和β-羟丁酸(BHBA)生化特性;能量负平衡时,奶牛血浆瘦素与血浆Glu、E2、P4之间呈显著正相关,与BW损失、血浆NEFA之间呈明显负相关;能量平衡时,奶牛血浆瘦素与DMI、Glu、Ins之间呈显著正相关,与Bw损失呈显著负相关,与血浆E2和P4之间相关不显著.这些结果提示,奶牛泌乳早期易发能量负平衡不仅与干物质摄入量、体重、泌乳量密切相关,而且与机体内分泌未完全协调发挥作用有关.能量负平衡明显降低泌乳早期奶牛的生产性能和繁殖性能.血浆瘦素与生产性能指标、血浆生化指标的相关性分析证实瘦素在奶牛能量平衡、生产性能和繁殖性能之间起到一个平衡纽带的作用.     

患骨营养不良奶牛补钙前后血浆Ca、P、AKP含量的变化

选取患骨营养不良的荷斯坦牛群17头,日粮中将磷酸氢钙(127.5g/头.d)改换为石灰粉(200g/d.头)饲喂30d。在治疗前1d和治疗后30d测定试验奶牛血浆Ca、P、AKP含量。结果显示,患病牛群治疗前低血钙发病率(82.35%)显著高于治疗后(17.65%)(P0.01)。治疗后血浆Ca浓度显著高于治疗前(P0.01),血浆P浓度显著降低(P0.05),血浆Ca:P显著升高(P0.05),血浆AKP略升高(P0.05)。结论:日粮钙含量低所致的钙磷比失调是本次奶牛骨营养不良发生的主要原因。     

奶牛围产期血浆Ca、P、AKP和HYP的变化

为了解健康奶牛围产期钙代谢特点,本试验选取围产期健康奶牛20头,分别在产前7d、3d,分娩当天,产后3d、7d对试验奶牛血浆Ca、P、ALP、HYP浓度进行测定。按每个时间点血钙水平将试验奶牛分为血钙正常组(C)和低血钙组(L)。结果显示:奶牛在产前7d至产后7d低血钙发生率分别为45%、20%、80%、25%、15%。产前7d到产后7d,C组奶牛血浆Ca、ALP、HYP水平均显著高于L组(P0.05)。两组奶牛血浆P浓度围产期无显著差异(P0.05)。结论:奶牛围产期易发生低血钙,以分娩时发生率最高;围产期奶牛低血钙症的发生可能与骨钙动员能力低有关。     

公路水泥混凝土路面设计中的问题探讨

结合交通部新颁布的公路水泥混凝土路面设计规范和公路路面设计中存在的问题,对设计参数和标准的选择进行分析论证,提出了合理的路面设计思想和方法。     

酮病奶牛血液极低密度脂蛋白(VLDL)的分泌特征

为探究围产期酮病奶牛极低密度脂蛋白(VLDL)的分泌特征,本试验利用ELISA试剂盒检测酮病奶牛血液中VLDL-ApoB的含量,超速离心分离VLDL颗粒,透射电镜观察颗粒大小,同时利用ELISA试剂盒以及LC-MS组学技术对奶牛血液VLDL颗粒进行脂质组学检测.结果 显示,临床型酮病奶牛血液中VLDL-ApoB的含量显...     

奶牛主要群发性生产疾病早期预警系统的设计与实现

为了实现奶牛主要群发性生产疾病的早期预警,降低养殖成本,以Asp.net和SQL Server2008为开发工具,采用SOA基础架构和三层分布式网络体系结构,采用UML进行可视化建模,运用迭代式开发方法设置阶段控制点来实现系统的研发过程,对奶牛主要群发性疾病,如酮病、钙磷代谢障碍等进行早期监测,为早期预报奶牛主要群发性生产疾病提供科学的依据。     

围产期酮病奶牛血液生化指标特征分析

试验随机选取产前奶牛29头,跟踪采集产前2周、产前1周、分娩当天及产后3,7,14,21 d的血浆样品,检测血浆相关生化指标变化特征,并记录泌乳量。任意采集时间点血浆β-羟丁酸(BHBA)≥1.2 mmol/L则为酮病组, BHBA<1.2 mmol/L则为对照组。结果显示:随机选取的牛群中酮病发病率为58.6%,酮病主要发生在产后7～14 d;酮病组奶牛产前血液相关生化指标与对照组相比无显著性差异;与对照组相比,酮病组奶牛分娩当天血钾水平升高,血磷水平显著降低;产后3 d酮病组奶牛血浆甘油三酯、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、BHBA、泌乳量显著高于对照组奶牛;产后7,14,21 d血浆BHBA、非脂化脂肪酸(ENFA)、TC、HDL-C、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平极显著高于对照组奶牛,血糖水平显著低于对照组奶牛。二元Logistic回归分析显示:产后3 d血液TC、HDL-C、K、BHBA、泌乳量与奶牛酮病的发生显著相关。将显著性相关指标利用Logistic回归建模,最终建立了基于血液HDL-C、BHBA、泌乳量的奶牛酮病早期诊断模型,即y=17.95-9.81×HDL-C-2.71×BHBA-0.20×泌乳量,当y<0时存在发生酮病风险,模型早期预测奶牛酮病的准确率82.8%、灵敏度81.3%、特异性84.6%。     

亚临床酮病对泌乳早期奶牛繁殖性能的影响

为探究围产期亚临床酮病与泌乳奶牛繁殖性能及卵泡发育之间的关系,本试验选择了黑龙江省某大型集约化牛场开展试验,根据产后血酮水平确定亚临床酮病组和健康组奶牛共80头,该牛场亚临床酮病发生率为71%;两组奶牛跟踪到产后50 d进行直肠检查和B超检查了解卵泡发育状况,并记录繁殖性能数据。结果显示:与健康组奶牛相比,亚临床酮病组奶牛产后首次发情天数延长10 d,产后60 d内发情次数少0.58次;产后50 d子宫复旧不全高15%,与亚临床酮病呈显著正相关(R^2=8.74);产后60 d卵泡直径小3 mm(P<0.05)。结论:该牛场奶牛亚临床酮病发病率较高,是引起奶牛产后繁殖障碍的风险因素,也是造成卵泡发育受阻的不良因素,会导致奶牛繁殖力下降。