应用SELDI-TOF-MS技术对患脂肪肝奶牛血浆差异蛋白的分离鉴定及生物学分析

【目的】脂肪肝是围产期奶牛主要代谢性疾病之一,50%产后奶牛受其影响。产后奶牛生产力降低、繁殖性能低下、免疫功能减弱、肝功能衰竭和过早死亡都与脂肪肝有关。表面增强激光解析/电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）是一种对生物样本蛋白质研究的新型高敏感性蛋白质组学方法,文章旨在探讨脂肪肝奶牛血浆蛋白质组学特征。【方法】于黑龙江某集约化养牛场选择产后7-28d,1-2胎次荷斯坦奶牛40头。清晨空腹尾静脉采血10mL,应用肝素抗凝（150U）迅速离心（3 000 r/min,5 min）分离血浆,置于-80℃冰箱冷冻保存。依据血浆甘油三酯（TG＞0.20 mmol·L^-1）, 血浆β-羟丁酸（BHBA＞1.2mmol·L^-1）浓度和临床症状,将其分为试验组（T）20头和健康对照组（C）20头。应用SELDI-TOF-MS技术测得血浆蛋白质谱,利用Ciphergen Protein Chip Software (Version 3.1.1)对在试验组和对照组所有样品中得到的峰图进行分析,得到原始数据。将两组之间的数据峰值做wilcoxon sum rank test统计检验,用计算出的P值判断峰在两组中是否有显著差异。以0.01作为P值的阈值,筛选出P值小于0.01的差异峰。在得到的差异峰中,将差异峰的m/z值与Swissport蛋白数据库中多肽的理论荷质比 (mass to charge ratio,m/z)进行比较,找到最相似的蛋白作为差异峰可能检测蛋白的预测结果。【结果】与对照组相比,试验组奶牛血浆蛋白质谱存在39个差异峰,在得到的39个差异峰中,将差异峰的m/z值与Swissport蛋白数据库中多肽的理论荷质比值进行比较,最终获得26个可预测的差异峰,预测蛋白11种。结果显示,相对于C组,11种预测蛋白在T组中均表达下调。通过生物信息学（Network,GO,Pathway）分析,应用Cytoscape软件对获得的11种蛋白进行牛类基因网络搜索,得到Networks分析结果图。在数据库中搜索到了试验结果中的淀粉样肽前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)和纤维蛋白原α链(fibrinogen alpha chain, FGA)两种差异蛋白,并得到其相关的Networks分析结果。应用Cytoscape软件中BinGO插件对11种蛋白进行GO分析,并得到GO分析结果。对这些蛋白质经软件搜库得到已经注释的差异蛋白有9种,分别为FGA、血清淀粉样蛋白A (serum amyloid A protein, SAA)、血浆蛋白酶c1抑制剂（plasma protease c1 inhibitor, SERPING1 or C1INH）、血清载脂蛋白-CⅢ（apolipoprotein c-Ⅲ,ApoCⅢ）、海帕西啶（hepcidin, HAMP）、骨桥蛋白（osteopontin, OPN or SPP1）、 甲状腺素运转蛋白（transthyretin, TTR）、胱蛋白酶抑制剂C （cystatin-c, CysC or CST）、神经分泌血管生长因子蛋白（neurosecretory protein, VGF）。应用KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）pathway数据库搜索。搜索结果显示只有6种蛋白质可在数据库中搜到,分别是FGA、SERPING1、APO-CⅢ、APP、CysC、SPP1。并得到其相关的Pathway分析结果。这些蛋白可能是与奶牛脂肪肝发病机制相关的物质。【结论】应用SELDI-TOF-MS技术有效的分离了健康牛与患病牛之间的血浆差异表达蛋白,均在肝脏代谢或脂肪肝疾病发生发展过程中起重要的调节作用,对探究奶牛脂肪肝发病机理及其对机体生物学功能的影响具有重要的理论价值。差异蛋白对奶牛脂肪肝的发病机理的影响尚待进一步研究。     

奶牛局限性脂肪肝的超声诊断

随着集约化养殖程度的提高和品种改良的加速,以及对高产奶量的片面追求,奶牛营养代谢病,特别是以脂肪肝为代表的营养代谢病长期以来居高不下,临床上主要表现为局限性脂肪肝,但没有合适的常规诊断方法,血液生化指标亦缺乏特异性,因此影像学诊断成为十分重要而实用的临床诊断手段。就奶牛脂肪肝的分类、诊断及几种奶牛局限性脂肪肝的超生诊断进行了综述,并结合奶牛脂肪肝病例阐述了超声诊断的应用,对奶牛脂肪肝的诊断、治疗具有重要意义。     

高脂饮食构建大鼠脂肪肝模型的研究现状及分析

奶牛脂肪肝是泌乳初期高产奶牛易患的一种主要代谢疾病,常伴随奶牛产奶量、繁殖能力和免疫力的下降。由于奶牛的经济价值,不宜直接用于大批量实验造模研究,因此应用小动物建立理想的动物脂肪肝模型对奶牛脂肪肝的研究具有重要意义。通过查阅文献发现高脂饮食方法复制大鼠脂肪肝是研究动物脂肪肝常用的一种模型构建方法,而高脂饮食主要是指通过高脂高胆固醇饮食和高脂高糖饮食两种方式诱导大鼠产生脂肪肝,所以就目前关于这两种造模方法进行综述,旨在为奶牛脂肪肝的进一步研究、预防和治疗提供理想的动物模型。     

奶牛能量状态对血清FGF-21水平的影响

为了明确能量代谢负平衡奶牛血清中成纤维细胞生长因子(FGF-21)浓度的变化规律以及与奶牛能量代谢负平衡特征性指标之间的关系。研究从某千头奶牛场选取选择非妊娠、非泌乳、健康奶牛10头,随机分成2组,每组5头。在实验期间,一组牛饲喂120%维持(1.48 Mcal·kg~(-1))日粮,另一组饲喂30%维持能量(0.37 Mcal·kg~(-1))日粮(NRC标准),每天采集血液样品,检测能量代谢特征性指标,其中,血清理化指标采用全自动血液生化分析仪进行测定,激素指标Elisa试剂盒进行检测。所有检测数据均采用统计学方法进行分析与统计。结果显示:摄入30%维持能量(0.37 Mcal·kg~(-1))日粮的牛血清FGF-21水平同时显著升高;饲喂120%的维持日粮的牛血清FGF-21水平同时显著降低。实验检测指标中血清FGF-21指标与瘦蛋白(LP)为正相关,与血糖(Glu),β羟丁酸(BHBA)为负相关。结论:实验表明FGF-21与能量密切相关并且在奶牛能量代谢平衡状态的调控中发挥作用,为今后深入探究能量负平衡的发生机理和新的防治策略奠定了基础。     

奶牛围产期低血钙发生状况及其调节作用

为了解奶牛围产期低血钙发生状况及其调节作用,本试验选取围产期经产的健康奶牛20头,分别对其产前21d、14d、7d、产后7d、14d、21d及分娩当天血中钙(Ca)、磷(P)、碱性磷酸酶(ALP)、羟脯氨酸(HYP)、甲状旁腺素(PTH)、骨钙素(BGP)、降钙素(CT)浓度进行测定.按血钙水平将试验奶牛按上述时间点均分为对照组(血钙正常)和低血钙组.结果显示:奶牛在产前21d至产后21d低血钙发生率分别为:0%、45%、20%、80%、25%、15%、10%.对照组奶牛血浆Ca、BGP的浓度产前14d到产后21d显著高于低血钙组(P<0.05),ALP、HYP在产前7d到产后21d显著高于低血钙组(P<0.05).两组奶牛血浆P浓度在围产期无显著差异(P>0.05).对照组血浆CT浓度在产前7d和分娩当天显著低于低血钙组(P<0.05),其他时间点差异不显著(P>0.05);对照组血浆PTH浓度在产前7d到产后21d时显著低于低血钙组(P<0.05).结论:奶牛围产期易发生低血钙,以分娩时发生率最高.奶牛围产期易发低血钙与钙代谢调节激素未能发挥其动员骨钙的调节作用有关.     

畜牧兽医学科重点项目立项领域与资助情况回顾与分析

国家自然科学基金重点项目支持科技工作者结合国家需求,针对我国已有较好基础和积累的重要研究领域、对学科发展具有重要推动作用的领域或对新学科生长点开展深入、系统的创新性研究工作。本文对近年来畜牧兽医与水产学科重点项目立项领域的设立与申请资助情况进行了回顾与总结,其目的是进一步针对国家需求、瞄准国际前沿,充分利用本学科的优势,继续支持创新研究,为提升本学科基础研究的整体水平发挥重要作用,也为从事该专业的科研人员申报科学基金提供参考。     

亚临床酮病对泌乳早期奶牛繁殖性能和血液生化指标的影响

试验旨在探究围产期亚临床酮病与泌乳早期奶牛繁殖性能、卵泡发育之间的关系,并检测试验牛血液生化指标的变化。试验在黑龙江某大型集约化牛场开展,根据产后血酮水平确定亚临床酮病组（SCK）和健康组（C）奶牛共60头,根据试验牛产后50 d内发情状况,将SCK组再分为发情组（SCKE,16头）和乏情组（SCKA,14头）,C组也同样分为发情组（CE,25头）和乏情组（CA,5头）。所有试验牛在产后50 d通过直肠检查和B超检查了解子宫复旧及卵泡发育状况,记录繁殖性能数据,并进行血液生化指标分析。结果表明：与健康组发情奶牛相比,亚临床酮病发情奶牛产后首次发情日期推迟约10 d（P<0.05）;产后50 d卵泡直径差异极显著（差值约4 mm）（P<0.01）。亚临床酮病乏情奶牛子宫复旧延迟发生率显著高于健康组发情奶牛（P<0.05）;亚临床酮病奶牛血浆中胰岛素样生长因子-1（IGF-1）含量显著低于健康奶牛（P<0.05）,而泌乳量极显著提高（P<0.01）。与发情奶牛相比,乏情奶牛血浆中甘油三酯（TG）含量显著升高（P<0.05）;葡萄糖（Glu）、胰岛素（Ins）、雌二醇（E₂）、孕酮（P₄）含量显著或极显著降低（P<0.05;P<0.01）。综合以上试验结果,奶牛患亚临床酮病而导致能量代谢指标异常是引起奶牛乏情、产后卵泡发育受阻和繁殖障碍的主要因素,进而导致奶牛繁殖力下降。     

RHIGF-Ⅰ对体外单层培养的肝细胞PEPCK mRNA 丰度的影响

根据牛肝细胞中持家基因表达的恒定性,选用β肌动蛋白（β-actin）作为内参照,检测外源性添加不同质量浓度的重组人胰岛素样生长因子（RHIGF-Ⅰ）对体外培养牛肝细胞磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）mRNA表达水平的变化情况。选用体外培养的犊牛单层肝细胞为实验模型,当细胞贴壁后在无血清培养液中添加RHIGF-Ⅰ,其终质量浓度分别为0、5、10、15、20、30、40、50、60、100、150μg/L,待添加8h后,提取总RNA,反转录,用相同的模板扩增PEPCK基因及β内参,再比较各梯度目的基因与内参的灰度。结果表明,随着添加RHIGF-Ⅰ质量浓度的升高,PEPCK mRNA表达呈下降趋势,且均低于对照组。     

瘦蛋白对体外培养的新生牛脂肪细胞Ob-Rb mRNA表达的影响

取单层生长良好的脂肪细胞，采用单因素试验，分别添加浓度为5ng／mL外源牛重组瘦蛋白（每12h添加1次）不添加作为对照至4、12、24、36、48和72h后提取总RNA，每个处理3个重复（孔），应用竞争RT-PCR法检测外源瘦蛋白对初生犊牛脂肪细胞Leptin长型受体（Ob—Rb）表达水平的影响，结果与对照组相比在12～24h内随着培养时间的增加，脂肪细胞Ob—Rb表达水平量亦显著增加（P〈0．01），之后其表达量逐渐回降，在48～72h趋于平稳（P〉0．05）。结果表明，在一定时间内瘦蛋白可提高体外培养的新生牛脂肪细胞Ob-Rb mRNA的表达水平。