禽流感不同免疫程序的效果观察

为了探索适合湖州地区的禽流感免疫程序，切实提高禽流感的防控水平，笔者进行了不同免疫程序的试验，现将试验情况总结报告如下：     

应用Cre-loxP系统构建伪狂犬病病毒gE/TK双缺失株

为了构建无报告基因的猪伪狂犬病病毒(PRV)gE/TK双缺失株,以PRV-JSZ株为亲本毒株,增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因,先构建出带有loxP位点的rPRV-gE-/GFP,通过Cre重组酶处理后,获得剔除EGFP的gE单缺失株rPRV-gE ;再以rPRV-gE为母本,以相同方法构建gE/TK双缺失株rPRV-gE/TK.荧光检测和PCR结果显示成功构建了gE单缺失株和gE/TK双缺失株 ;病毒生长曲线测定可见rPRv-gE在PK15细胞上的增殖速度与野生株相似,而rPRV-gE/TK较为缓慢 ;rPRV-gE/TK对小鼠的半数致死量大于1×105 TCID50,显著高于rPRV-gE和野生株 ;缺失株免疫小鼠强毒攻击后能提供80％的保护.这些结果表明以Cre/loxP系统可重复使用构建伪狂犬病病毒多基因缺失株,为研制伪狂犬病病毒基因缺失苗和载体疫苗提供了快速筛选的技术平台.     

H7亚型禽流感病毒血凝素基因的真核表达载体的构建及鉴定

参考已发表的H7亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因序列设计引物,以pUCH7为模板,经PCR扩增出一条1.7kb的HA全基因片段,将该片段定向克隆到真核表达质粒载体pcDNA3.1(一)中,转化大肠埃希氏菌DH5α,小量制备重组质粒pcDNA-HA,酶切鉴定正确后,转染COS-1细胞,经免疫荧光鉴定其体外表达情况。结果表明H7亚型AIV HA在COS-1细胞中获得了成功表达。用该重组质粒pcDNA-HA免疫BALB／C小鼠,制备免疫血清,经免疫印迹实验证实该H7亚型AIV HA在小鼠体内也得到了良好的表达。     

猪肺炎支原体特异性蛋白P36基因的克隆与表达

根据Genbank中猪肺炎支原体P36基因序列设计一对特异性引物,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增出猪肺炎支原体ZCF23株特异性蛋白P36基因序列,经测序确认后,克隆人原核表达载体pGEX 6p-1的EcoR I和Xho I位点之间,转化宿主菌BL21,将筛选出的阳性克隆用IPTC诱导,通过SDS-PAGE电泳进行鉴定,结果表明,P36蛋白基因获得了表达,这为猪肺炎支原体免疫检测与诊断提供了重要条件.     

猪瘟病毒非结构蛋白NS5A与Beclin1相互作用并促进病毒增殖

为探究宿主蛋白Beclin1在猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)非结构蛋白NS5A激活细胞自噬反应过程中的作用及具体分子机制,本研究在感染CSFV及表达NS5A蛋白的ST细胞中,利用qRT-PCR方法检测Beclin1、PI3K/Akt通路相关因子表达变化情况;利用激光共聚焦、Co-IP及GST-pulldown等方法研究Beclin1与NS5A相互作用关系;通过在ST细胞中过表达或敲低Beclin1,研究其对CSFV复制的影响。结果表明,ST细胞感染猪瘟病毒或外源表达NS5A蛋白,Beclin1转录和蛋白表达水平均显著升高,且PI3K/Akt通路相关因子表达水平与之呈正相关。此外,CSFV NS5A蛋白与Beclin1蛋白在细胞中存在共定位且具有相互作用。最后,作者发现在细胞中过表达Beclin1,对CSFV复制起到明显促进作用;反之,利用siRNA敲低Beclin1后,抑制PI3K/Akt通路活化,CSFV增殖表现出明显抑制效应。以上结果表明,Beclin1蛋白对CSFV复制具有促进作用,其机制是通过与NS5A的相互作用调控PI3K/Ak...     

家禽生产“123+3456”生物安全体系的建设与实践

生物安全是预防疾病最好的方法,良好的生物安全体系可以切断疾病传入鸡群的大多数途径.也是最有效、成本最低的健康管理措施.广义的生物安全是指:为了保证动物健康而采取的所有措施,其中包括卫生、隔离、消毒、免疫、监测、治疗等6项措施.狭义的生物安全是指为了降低病原侵入和传播风险而采取的所有措施.狭义的生物安全分为两部分:一是外...     

原核真核双表达加强型绿色荧光蛋白质粒的构建

将原核启动子Ptrc和加强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因从EGFP原核表达质粒pYA3334—EGFP上切下，然后将其插入至真核表达质粒pVAXI真核启动子Pcmv的下游，构建成具有真核和原核启动子的双表达杂合质粒pVAXD-EGFP，其长度为3823bp。将pVAXD—EGFP分别转化鼠伤寒沙门氏菌X4550和转染COS—7细胞，应用流式细胞术、可见光谱扫描、SDS—PAGE测定EGFP原核表达；应用荧光显微镜观察EGFP在COS—7细胞内的表达。重组鼠伤寒沙门氏茵X4550(pVAXD-EGFP)表达EGFP的量与仅以原核方式表达EGFP的X4550(pYA3334—EGFP)相当；将质料pVAXD-EGFP转染COS—7细胞，EGFP可在COS—7细胞核和胞浆表达，在荧光显微镜下发出强烈荧光。结果表明：不仅成功地构建原核、真核表达集中于同一质粒的新型质粒pVAXD-EGFP，而且原核、真核目的蛋白表达量达到很高水平，显示其在新型重组细菌疫苗方面有着诱人的应用前景。     

基于数据挖掘及网络药理学方法探讨中药复方抗上呼吸道感染的用药规律及作用机制

[目的]研究中药复方治疗上呼吸道感染的用药规律及核心中药的作用机制。[方法]通过CNKI数据库收集临床用于上呼吸道感染的中药复方,采用Excel 2010及SPSS 24.0软件对纳入标准的中药进行频次、性味归经、四气五味及功效统计,并对频数大于40的中药进行聚类分析;使用中药系统药理学分析平台数据库(TCMSP)对频数较高且在聚类分析中聚为一类的配伍中药进行成分、靶点筛选,将其靶点与在GeneCards数据库和Malacards数据库中筛选得到的上呼吸道感染的疾病靶点进行匹配,获取高频中药治疗上呼吸道感染的关键靶点;采用STRING平台对关键靶点进行蛋白相互作用(PPI)网络分析;采用DAVID数据库对关键靶点进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析;通过Cytoscape 3.6.1软件构建“中药-活性成分-关键靶点-通路”网络,并进行拓扑分析。[结果]共获得符合标准的中药复方464首,涉及中药414味;其中以补虚药、清热药较多见,归肺、胃经居多,以寒温、苦辛为主;累计频次最高且聚为一类的是黄芪、防风、白术。获得活性成分共32个,核心成分包括槲皮素、山柰酚、异鼠李素、汉...     

2016-2019年我国部分地区鸡滑液囊支原体分离株vlhA基因遗传进化分析

为了解我国鸡滑液囊支原体(Mycoplasmasynoviae,MS)感染的最新流行情况,本研究于2016-2019年从江苏、安徽、山东、河南、河北、宁夏、黑龙江、湖北等8个省份疑似发生MS感染的鸡场采集样品,进行MS菌株的分离鉴定,结果共获得48株MS分离株.对这些分离株的vlhA基因片段测序和分析显示,其中46株均...     

无抗性表达致PWD和ED大肠杆菌保护性抗原基因的重组菌构建

利用平衡致死系统成功地将构建表达致PWD和ED大肠杆菌保护性抗原基因的重组菌BL21(pFSFaeG)中所含氨苄抗性基因敲除,并转化沙门氏菌宿主菌X4550。经过质粒酶切分析和表达产物的SDSPAGE证实,氨苄抗性基因已经成功敲除,并且目的蛋白仍与谷胱甘肽转移酶相融合,得到有效表达,重组融合蛋白的分子质量约为80ku。经体外连续传代试验,重组菌X4550(pFSFaeG)均能在无抗生素压力下大量扩增并稳定传代,质粒稳定性和蛋白表达稳定性良好。无抗性重组菌的成功构建解决了基因工程疫苗抗性基因潜在危险问题,并有望通过沙门氏菌载体的递送作用,为研制口服疫苗奠定了基础。