RAD-seq技术在柞蚕SNP开发及遗传图谱构建中的应用前景

柞蚕(Antheraea pernyi)是鳞翅目大蚕蛾科绢丝昆虫,具有可观的经济价值和食用价值。目前,在柞蚕基因组研究中仍没有SNP标记开发及遗传图谱构建的相关报道。以高通量测序为基础的简化基因组测序技术RAD-seq,以其流程简单,不受有无参考基因组的限制,费用低廉,一次测序就可获得海量SNP标记等特点,适用于柞蚕的基因组学研究。RAD-seq技术在许多物种中,已成功用于超高密度遗传图谱的构建、重要性状基因的精细定位等研究。本文主要介绍RAD-seq技术及其在基因组学研究中的应用,为促进该技术在柞蚕遗传标记开发和遗传图谱构建中的应用,推动柞蚕育种工作的快速发展奠定理论基础。     

基于EST数据的柞蚕SSR标记开发

柞蚕SSR标记的开发对研究柞蚕的遗传与进化、分子遗传图谱构建、功能基因定位和克隆等有重要意义。从1 500条柞蚕表达序列标签(EST)中鉴定了71个SSR位点,平均5.2 kb出现1个SSR位点,在1~6个碱基的重复基元中,以3个和4个核苷酸重复为主导类型。设计合成了29对EST-SSR引物,通过PCR扩增和电泳检测鉴定了7对具有多态性的引物,测序验证结果表明其中的4对为有应用价值的EST-SSR标记。建立的利用EST数据开发柞蚕SSR标记的方法,有助于进一步大量开发柞蚕SSR分子标记。     

昆虫共生菌沃尔巴克氏体(Wolbachia)的wsp基因密码子使用模式分析

沃尔巴克氏体(Wolbachia)主要感染昆虫等节肢动物,是一类革兰阴性共生细菌。为探讨昆虫纲共生菌Wolbachia的系统发育,研究Wolbachia基因组中进化速度较快的外膜蛋白基因wsp的密码子使用模式及影响因素,统计分析该基因的GC含量(GCall、GC1、GC2、GC3、GC3s)、有效密码子数(ENc)、相对同义密码子使用度(RSCU)等指标。结果显示:昆虫纲共生菌Wolbachia的wsp基因密码子偏好性均不强,昆虫纲不同目间共生菌Wolbachia的wsp基因碱基组成及ENc值差异较小;多数基因数据点沿标准曲线或在其附近分布,突变对碱基组成的影响较弱;18种由多个密码子编码的氨基酸中有11种氨基酸的偏好性密码子在昆虫纲7个目及对照蛛形纲1个目间均相同,有2种氨基酸的偏好性密码子在7个目间相同,这些密码子均以A/U结尾;供分析的140个wsp基因中仅编码6个半胱氨酸(Cys);对应分析中第1、第2向量轴贡献率均不高,分别为13.53%和12.49%,均与碱基组成(GC1、GC2、GC3)显著相关。综合各项分析认为,Wolbachia的wsp基因密码子偏好性不具有宿主分类特异性,密码子使用模式主要受碱基组成影响,而碱基组成主要受选择影响。     

不同时间段柞蚕卵主要性状的差异

对辽蚕582、9906、抗大三个品种的不同产卵时段的柞蚕主要性状进行分析,得出第一昼夜卵具有更优良的经济性状,更有利于柞蚕良种繁育。秋季卵期调查中,三个柞蚕品种第一昼夜卵平均不受精卵数和平均卵重均优于第二昼夜卵。秋季放养调查中,三个品种第一昼夜卵平均发病率和产茧重量均优于第二昼夜卵。结果显示第一昼夜卵其主要性状均好于第二昼夜卵,因此选留第一昼夜卵放养,在柞蚕繁育过程中可达到抗病、抗逆及高产的要求。     

不同柞蚕品种的热应激反应差异及2个热激蛋白基因的表达特征

野外放养柞蚕经常会受到高温环境胁迫,研究不同柞蚕品种对高温的应激反应和耐受性机制,有利于科学地评价柞蚕种质资源对环境的适应能力。调查5个柞蚕品种或品系5龄幼虫在42℃和45℃胁迫1～4 h后的热应激行为表现、高温胁迫后的恢复能力和胁迫处理后室温饲养48 h的死亡率,结果显示,方山黄和F的耐热性较好、恢复能力较强,高温胁迫后48 h抗大和F的死亡率较低。高温胁迫1 h后分别取2个胁迫试验组5个柞蚕品种5龄幼虫的脂肪体,qRT-PCR检测热激蛋白基因ApHSP70与ApHSP90的表达变化,结果显示:胁迫后不同品种ApHSP70基因的表达量均显著高于对照组(395～1 124倍),以方山黄的胁迫组和对照组表达量最高;42℃胁迫组抗大与9906、45℃胁迫组5204与9906的ApHSP70基因表达量无显著差异(P>0.05),其余均呈极显著差异(P<0.01)。高温胁迫后不同品种ApHSP90基因的表达量也明显高于对照组(26～460倍),仍以方山黄的胁迫组和对照组表达量最高;42℃对照组方山黄与其他品种ApHSP90的表达水平呈显著差异(P<0.05),而42℃方山黄对照组与抗大胁迫组无显著差异(P>0.05);42℃胁迫组5204与方山黄的ApHSP90基因表达水平呈显著差异(P<0.05),45℃胁迫试验组的抗大与F的ApHSP90基因表达水平不存在显著差异(P>0.05),其余均呈极显著差异(P<0.01)。研究结果可为柞蚕种质资源耐高温胁迫能力评价与柞蚕抗逆性新品种选育提供参考。     

RNAi技术研究现状及其在柞蚕基础应用研究的前景

RNAi技术目前已在昆虫基因研究中得到广泛应用,它是由双链RNA诱发并最终导致同源mRNA特异性沉默的过程。本文对国内外dsRNA的设计、导入方法及RNAi技术的应用进行了综述,对RNAi技术在柞蚕基础研究中的应用作一展望。     

基因编辑技术及其在柞蚕基础研究中的应用前景

基因编辑技术是功能基因研究和生物遗传改良的重要手段.本文以第三代人工核酸内切酶编辑技术成簇的规律间隔的短回文重复序列系统(CRISPR/Cas)为主,以鳞翅目模式生物——家蚕为例,简要介绍了基因编辑技术的原理及研究成果,总结了开展柞蚕基因编辑可能遇到的问题及相应解决策略,展望了基因编辑技术在柞蚕基础研究中的应用前景,以期为柞蚕后基因组时代的基因功能分析、突变模型建立、品种遗传改良等研究提供参考.     

39份二化性柞蚕品种资源主要数量性状的遗传多样性分析

柞蚕品种资源数量性状的遗传多样性分析,有利于柞蚕新品种选育过程的优良亲本选配及性状改良。在对辽宁蚕区保存的39份二化性柞蚕品种资源的7项数量性状连续5年进行统一调查的基础上,通过变异系数、多样性指数和聚类分析明确其遗传多样性。除实用孵化率和克卵粒数2项性状的变异系数较低外,产卵数量、产卵量、全茧量、茧层量和茧层率5项性状均有较高的变异系数,其中产卵数量、产卵量和茧层量的变异系数分别达到了11.29%、13.87%和11.86%,并且各项性状的分布频率表现出一定的集中性。除实用孵化率的Shannon-Weaver多样性指数较低外,产卵数量、产卵量、克卵粒数、全茧量、茧层量和茧层率的遗传多样性指数均较高,表明这些性状蕴含丰富的遗传变异。利用DPS数据处理系统,以最短距离法对距阵结果进行聚类分析,将39份柞蚕品种资源分成6个类群,其中4个从国外引进的改良品种聚为一大类群,印证了柞蚕品种资源的亲缘关系与地理来源有关。上述结果显示供试39份二化性柞蚕品种资源7项主要数量性状的遗传多样性丰富,尤其是产卵数量、产卵量和茧层量等性状有较大的遗传潜力,可应用于品种改良;而实用孵化率的遗传潜力小,育种过程不易进行性状改良。     

柞蚕种质资源茧期性状分析与遗传多样性评价

文中利用变异系数、Shannon-Wiener多样性指数、相关性分析及聚类分析等方法,对50份二化性柞蚕种质资源的茧长、茧幅、茧形指数(茧长/茧幅)、千粒茧重、全茧量、茧层量及茧层率7个茧期性状进行统计分析。供试柞蚕种质资源间变异系数的变幅为1.36%～14.76%,茧层量的变异系数最大(14.76%),茧形指数的变异系数最小(1.36%);Shannon-Wiener多样性指数的变幅为1.94～2.06,全茧量指数最高(2.06),茧形指数最低(1.94),表明柞蚕种质资源茧期性状(除茧形指数外)具有较为丰富的遗传多样性,各性状间存在复杂的相互关系。基于7个茧期性状的聚类分析将50份柞蚕种质资源划分为3个类群,第Ⅰ类群包含18份种质,多为实用型种质;第Ⅱ类群包含13份种质,多为特殊遗传材料;第Ⅲ类群包含19份种质,多为多丝型种质。研究结果可为柞蚕种质资源的高效利用提供参考。     

柞蚕幼虫蓝体色和青绿体色的遗传规律分析

柞蚕(Antheraea pernyi)幼虫体色是柞蚕新品种选育的重要形态标记性状。已知柞蚕幼虫体色的控制基因G(g)、Y(y)、R(r)位于不同染色体上,非等位基因间存在互作关系。以幼虫体色分别为蓝色、青绿色的柞蚕品种胶蓝、青皮为研究材料,与幼虫体色分别为白色(基因型rryygg)、黄绿色(基因型rryy GG)的柞蚕品种小白蚕、青6号配制胶蓝×小白蚕、青皮×小白蚕、胶蓝×青6号和胶蓝×青皮的正反交F1、F2、F3和BC1等组合进行杂交试验,调查分析柞蚕幼虫蓝体色和青绿体色的遗传方式。通过胶蓝与小白蚕杂交试验的幼虫体色分离规律,推测柞蚕幼虫蓝体色与白体色的控制基因存在1对差异基因,将柞蚕幼虫蓝体色基因命名为B,则柞蚕品种胶蓝幼虫的体色基因型为rryygg BB;通过青皮与小白蚕杂交试验的幼虫体色分离规律,推测柞蚕品种青皮幼虫青绿体色的基因型为rryy GGBB;通过胶蓝、青6号和青皮3个品种间杂交试验的幼虫体色分离规律,推测蓝体色基因B与黄绿体色基因G分别位于不同连锁群,为独立遗传;当基因B与基因G共存(rryy G_B_)时,柞蚕幼虫体色表型为青绿色,属不完全显性遗传。