基于SSR标记的中国亚洲韧皮杆菌种群结构研究

【目的】亚洲韧皮部杆菌是柑橘黄龙病病原。通过筛选SSR（Simple sequence repeat）位点,分析中国境内亚洲韧皮部杆菌（‘Candidatus Liberibacter asiaticus’）的群体结构。【方法】根据已报道亚洲韧皮部杆菌基因组上的25个SSR位点,使用中国不同地理来源的样品,对报道的SSR位点进行筛选,找出其中适宜进行中国样品群体结构分析的位点。应用PCR的方法,对收集的中国境内的285个亚洲韧皮部杆菌相应SSR位点进行扩增,聚丙烯酰胺凝胶电泳。所得电泳图导入软件Quantity One 4.5.0读取产物的碱基数。通过PopGen version 1.31软件评估选出的位点和不同地理来源的样品的多态性,分别使用软件Powermarker 3.25和structure 2.3.4进行聚类分析。【结果】共选出5个SSR位点可用于中国种群结构研究,Nei's多样性指数0.1542-0.9556。其中LasA位点多态性最高,有效等位基因数NE=22.5,Nei's多样性指数H=0.9556。通过这5个位点分析中国境内8个不同地理来源的样品,发现云南省样品存在较高多态性,NE=5.7,H=0.6580。8个地理种群间的遗传距离0.0236-0.5786,遗传相似度0.5607-0.9767,广西和四川遗传距离最大,遗传相似度最小。Powermarker软件以UPGMA方法进行聚类分析的结果显示,所有样品分为两个组群,四川和云南为一个组群;福建、浙江、贵州、广东、广西和江西为一个组群。Structure软件分析也得出了相似的结果,云南和四川样品的种群构成较为单一,90%以上个体为同一组群,而其他6个地理来源不同程度的为两个组群的混合。【结论】基于5个SSR位点分析中国境内的Ca. L. asiaticus表明其可能存在两种不同的群体结构,为进一步研究中国柑橘黄龙病的发生和流行规律提供了有价值的线索。     

高质量提取柑橘样品中病原总核酸方法的建立

针对柑橘老熟组织中富含多糖、多酚、色素和其它次生代谢产物的特点,以柑橘老叶老皮为试材,在传统CTAB提取法的基础上通过添加增效剂并优化配方,建立了一种快速、简便的提取植物老熟组织及其内部病原总核酸的CTAB-Triton提取法。新的提取液对细胞的裂解能力更强,且解决了传统CTAB溶液因低温析出而致DNA得率损失的弊端。比较了该法和微量葡聚糖柱纯化法制备模板时韧皮部杆菌的检出率,并用该法制备模板,分析了韧皮部杆菌在柚子叶片中的分布情况,及对其它几种柑橘病原菌进行PCR/RT-PCR检测。结果表明,CTAB-Triton方法能有效提取柑橘老熟叶片的DNA,所得DNA质量高,产量比商品化试剂盒大,提高了韧皮部杆菌的检出率,且可用于柑橘其他病原真菌、细菌,以及DNA或RNA病毒病害的PCR/RT-PCR检测,也可用于定量PCR检测和病原种群多态性分析。     

柑桔黄龙病菌LAMP检测制样方法比较

分析比较了CTAB-trion法、磁珠法、裂解法、浸提法等4种制样方法对环介导等温扩增(LAMP)法检测柑桔黄龙病的影响。结果表明,CTAB-trion法和磁珠法提取的核酸质量最好,其OD_(260)/OD_(280)值在1.8~2.0之间,满足LAMP扩增要求,但操作步骤繁琐、成本较高,且CTAB-trion法需使用苯酚和氯仿等有害试剂;裂解法提取的核酸质量虽不高,但可满足LAMP扩增,同时其操作简便,成本低、耗时少,相对环保;浸提法提取的核酸无法满足LAMP扩增要求。裂解法是柑桔黄龙病LAMP检测的最佳制样方法。     

母猪产后管理及常见病的防治

母猪作为哺乳动物,在生产后很容易出现各种疾病,对母猪的身体健康不利,对猪场长期经济效益也有影响,对母猪的产后管理及常见病防治进行了介绍,旨在使母猪的产后管理及疾病防治更加科学化、合理化,确保母猪产后得到快速恢复,提高自身免疫力,减少疾病发生的概率.     

亚洲韧皮杆菌在单株脐橙病树的分布情况

【目的】研究亚洲韧皮杆菌(CLas)在纽荷尔脐橙病树的分布情况,为柑橘黄龙病(HLB)的防控提供参考依据。【方法】以1~3个枝条表现斑驳黄化叶片症状的纽荷尔脐橙病树为研究对象,对主干发出的5个主枝(A、B、C为斑驳黄化枝条,D、E为无症状枝条)的叶片分别取样,运用PCR和实时荧光定量PCR(qPCR)分别检测,用2-ΔΔCt法分析树体各部分黄龙病菌含量。对于果树上表现典型HLB病果但叶片无症状的结果枝,分别检测典型病果和相应叶片的感病情况。【结果】PCR对A、B、C、D、E的阳性检出率分别为88.57%、61.11%、54.17%、6.67%和0,qPCR对A、B、C的阳性检出率均为100.00%,对D、E的阳性检出率分别为40.00%和13.33%;2-ΔΔCt法分析发现,斑驳黄化叶片中病原菌含量更高,病果的阳性检出率高于相应的无症状叶片样品。【结论】CLas在表现典型斑驳黄化症状的叶片和果实中的含量及阳性检出率均较高,病原菌在病树中分布不均匀。在进行HLB检测时,应选取典型或疑似症状样品,并运用qPCR进行检测,一旦发现树体局部发病,应当整株销毁。     

中国柑橘黄龙病病原菌两个原噬菌体超变异基因遗传多样性

【目的】通过原噬菌体区域高度变异的基因位点研究柑橘黄龙病病原菌亚洲种（‘Candidatus Liberibacter asiaticus’）的种群分化,探讨病原菌种群遗传多样性水平和遗传结构。【方法】基于2种原噬菌体类型（SC1和SC2）对应的超变异基因区域设计2对引物（Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2）,对中国不同柑橘产区的224个‘Ca. L. asiaticus’株系进行PCR检测和序列分析。【结果】PCR扩增的条带类型呈多态性,具有4种条带类型（SC1-1、SC1-2、SC2-1和SC2-2）,西南地区以SC1-1型为主,广东、广西地区以SC2-1型为主,福建、江西、浙江地区没有明显优势的扩增型。分析SC1-1和SC1-2对应序列表明,其差异系由于132 bp的卫星序列和24 bp的小卫星序列2种串联重复序列数不同引起,而SC2-1和SC2-2的差异系由原噬菌体内部基因重排引起。【结论】中国不同地理来源病原菌株系在原噬菌体区域具有较丰富的多态性,对该基因区域研究将有助于揭示中国‘Ca. L. asiaticus’种群的遗传多样性。     

应用real-time RT-PCR监测柑橘衰退病毒强、弱毒株的时序变化

 使用褐色橘蚜在提前7个月预免疫接种了柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus,CTV）弱毒株CT11的锦橙植株上拮抗接种强毒株CT14,应用real-time RT-PCR技术,监测供试植株中CTV强、弱毒株的含量变化,同时采用内参基因18S rRNAF/R及nad5F/R校正检测结果。试验结果表明,在拮抗接种3个月内始终未能在预免疫的拮抗植株中检测出强毒株CT14。在25头蚜虫拮抗接种后45 d和50头蚜虫拮抗接种后10 d,绝大多数预免疫的拮抗植株中弱毒株的含量高于预免疫的负对照植株,此后弱毒株的含量基本下降到负对照植株的水平,而负对照植株内弱毒株的含量变化不明显。     

柑橘黄龙病菌侵染对甜橙叶片糖代谢的影响

【目的】研究甜橙（Citrus sinensis）在柑橘黄龙病菌（Candidatus Liberibacter asiaticus）侵染下不同时期糖代谢的变化,以探讨其与柑橘叶片中淀粉积累间的关系,为进一步阐明柑橘黄龙病的发病机理提供理论依据。【方法】以甜橙为供试材料,采用腹接接种病原的方法,试验组植株用感染黄龙病菌的芽条进行嫁接,对照组植株用健康芽条进行接种,每个植株均嫁接3个芽条。在检测到感病的植株中选取生长状况良好且接近的3株作为后续试验材料,每月采集1次成熟叶片,至10月份结束。采集的叶片立即抽提DNA和RNA,并进行可溶性糖及淀粉含量的测定,其余叶片用液氮速冻后保存于-80℃用于测定糖代谢过程中关键酶活性的变化,同时利用实时荧光定量PCR技术比较二者关键酶基因表达量的差异。【结果】随着病原菌胁迫时间的延长,可溶性糖和淀粉含量总体呈升高趋势,均在6月达到峰值,分别为对照的1.59和3.73倍,在感病后期开始有所下降;通过对二者的比值分析发现,感病植株的比值随时间的延长不断下降。在黄龙病菌侵染的不同阶段,各种酶的作用程度有所不同。感病植株的蔗糖磷酸合成酶（SPS）活性在感病初期迅速上升至顶峰,高达58.44 μg·g^-1·min^-1,至后期已略微低于对照;酸性转化酶（AI）总体显示出较高活性,各个时期均有显著性差异（P＜0.05）,感病中期活性最高为对照的2.91倍;中性转化酶（NI）活性在感病和对照中均维持较低水平,且变化趋势基本一致;可溶性淀粉合成酶（SSs）与束缚性淀粉合成酶（GBSS）协调作用,共同参与淀粉合成的调控;淀粉酶活性在感病不同时期均有所下降,在感病中期低至0.38 U·g^-1。定量PCR分析表明,蔗糖磷酸合成酶基因SPS1表达量显著升高,与其酶活性具有显著相关性（P＜0.05）。蔗糖分解相关基因中,蔗糖合成酶基因SuSy在感病不同时期的表达差异不大,变化幅度小;细胞壁酸性转化酶基因CSCWI在不同时期均上调表达,最高上调约7.4倍,且表达量一直维持在较高水平;与CSCWI相比,液泡酸性转化酶基因CUAI1的表达水平较低。淀粉合成相关酶ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因最高上调3倍左右;淀粉分解相关基因BAM3、MEX1和DPE2在不同时期有所下调,达到显著性差异水平（P＜0.05）。【结论】柑橘黄龙病感染甜橙后,对植株叶片中光合产物的形成与运转产生影响,扰乱宿主糖代谢平衡,与宿主淀粉积累及后期症状的产生有密切关系。