调动广大农民群众积极性实现林业跨越式发展

国家林业局明确提出把实现林业的跨越式发展作为新世纪初林业的战略任务。如何认识林业的跨越式发展，怎样抓住西部大开发的有利时机，实现林业的跨越式发展，是每一个林业工作者认真思考并努力实践的重大问题。本文就调动农民积极参与林业建设问题，谈一些看法。 一、发挥农民     

二代靶向测序在CRISPR/Cas9靶区筛选中的应用性研究

旨在利用二代靶向测序技术比较不同靶区对CRISPR/Cas9基因编辑结局的影响,为该技术应用过程中的靶区筛选提供技术参考。本研究进行如下试验:1)以小鼠Pyk2基因为研究对象,针对其第一外显子区设计3个靶区,通过打靶质粒构建、细胞转染及转染细胞DNA二代靶向测序等手段发现,不同靶区总体的基因编辑(Indels)效率相差较大(site1:32.0%;site2:7.9%;site3:69.5%),编辑修复的偏好性也存在较大区别;而对于同一靶区,总编辑效率在2组试验重复中较为稳定(site1:31.8%vs 32.3%;site2:7.4%vs 8.4%;site3:71.3%vs 67.8%),编辑的偏好性也相对一致;2)针对上述筛出的最佳靶区site1,通过sgRNA与Cas9体外转录、小鼠胚胎显微注射和移植及子代的基因型鉴定等手段,结果发现,上述靶区的基因编辑偏好性在基因编辑动物生产中也得到证实;3)利用上述得到的site1靶区插入一个碱基的突变小鼠,在原靶区位置设计与site1仅相差一个碱基的sgRNA。通过突变小鼠基因组PCR和Cas9酶体外切割试验发现,靶区切割位点单碱基的插入就对该靶区编辑的效率产生显著影响(49.2%vs 0%)。综上所述,靶区选择对CRISPR/Cas9基因编辑的结局影响显著,通过二代靶向测序可以有效筛选CRISPR-Cas9基因编辑靶区,并在模式动物生产过程中也获得较好的结果。此外,针对靶区切割位点的单个碱基插入对基因编辑效率影响显著。     

小鼠原钙黏蛋白的多样性分析及其亚型的克隆与表达

原钙黏蛋白(protocadherin)是广泛分布于中枢神经系统的一类跨膜蛋白,是钙黏蛋白家族中最大的亚族。成簇Pcdh基因包含3个串联的基因簇——Pcdhα、β、γ,其中Pcdhα和γ分别由14个和22个可变区及各自共同的恒定区组成。这种特殊蛋白结构决定了原钙黏蛋白各亚型在功能上既相似又不完全相同,为了系统研究原钙黏蛋白各个亚型的功能,本研究对原钙黏蛋白家族氨基酸序列保守性进行了系统性分析,并据此设计特异性的引物来完成原钙黏蛋白各个亚型的克隆;并以原钙黏蛋白α1基因为例,通过PCR方法成功将其从小鼠大脑中克隆并构建到带有Myc标签的真核表达载体pc DNA3.1上;利用脂质体转染方法将该基因成功表达于293T细胞。本研究结果将为后续其他亚型的克隆建立技术平台。     

玻璃化冷冻对小鼠GV期卵母细胞发育能力的影响

试验首次采用OPS法玻璃化冷冻小鼠GV期卵母细胞(不带卵丘细胞,下同),同时尝试用EDFS30对小鼠卵巢进行细管法玻璃化冷冻,以研究GV期卵母细胞冷冻后的发育潜力。首先,利用MEM培养和MEM-腔前卵泡培养新鲜GV期卵母细胞,并把较好的培养方式用于冷冻后培养试验。2种培养方式培养24h后新鲜GV期卵母细胞成熟率无显著性差异;OPS法冷冻的GV期卵母细胞解冻后成熟率及体外受精后卵裂率与对照组差异不显著(P>0.05)。细管法冷冻卵巢组织的GV期卵母细胞成熟率极显著低于对照组(P<0.01),其受精后未获得受精卵。结果表明:OPS法可有效地冷冻保存小鼠GV期卵母细胞,而细管法冷冻小鼠卵巢对GV期卵母细胞损伤较大。     

乙二醇及二甲基亚砜对小鼠卵母细胞冷冻后纺锤体及孤雌激活后发育能力的影响

试验采用EFS30、DFS30和EDFS30冷冻液对小鼠MⅡ期卵母细胞进行玻璃化冷冻,并对冷冻-解冻后卵母细胞存活率、纺锤体形态正常率、孤雌激活胚胎的发育能力进行研究。结果表明:利用EDFS30冷冻-解冻卵母细胞后的存活率(98.3%)显著高于EFS30组(88.2%)和DFS30组(89.5%)(P0.05);DFS30组纺锤体形态正常率(44.9%)显著低于其他各组;而孤雌激活后EFS30、DFS30、EDFS30和对照组之间卵裂率(59.1%、56.3%、59.3%和60.0%)、囊胚率(52.0%、53.7%、61.2%和62.1%)和囊胚细胞数(49、48、50、50)均无显著性差异(P0.05)。综上所述,3种冷冻液冷冻卵母细胞孤雌激活后均可获得较好的体外发育能力,其中EDFS30较适宜小鼠MⅡ期卵母细胞冷冻保存。     

堆肥中添加石灰氮分解产物对牛粪细菌及有机物分解菌生长的影响

为了进一步探讨有机物分解菌在堆肥过程中对有机物分解效果的影响,试验在堆肥中添加石灰氮分解产物单氰胺(cyanamide)或双氰胺(cicyandiamide),研究对粪便中有机物分解菌生长的影响。结果表明:鲜牛粪堆肥中添加3%单氰胺或双氰胺对牛粪中细菌、放线菌和有机物分解菌产生了一定的不良影响,影响了堆肥中有机物的降解。     

小鼠动情周期与超排效果

通过对25只小鼠用两种阴道涂片方法进行动情周期的观察,筛选出最佳涂片方法观察到的具有明显动情周期变化的小鼠进行超数排卵。根据不同生理周期将小鼠分组,分别为发情期(第1组)、发情后期(第2组)及间情期(第3组),而13只未知周期的小鼠作为对照组,比较各组间超排效果。结果表明:(1)用方法2涂片效果最好,方法2较方法1各时期阴道上皮细胞变化明显,对小鼠正常的生理周期影响相对较小,可观察到小鼠正常动情周期的变化规律。(2)不同生理周期小鼠的超排效果,以间情期可用胚百分率和平均每只小鼠获得胚胎数极显著高于发情期、发情后期及未知周期。     

小鼠桑椹胚OPS管内解冻和直接移植

本实验对昆明白系小鼠的桑椹胚实施OPS法玻璃化冷冻,研究不同管内解冻程序对胚胎体内外发育的影响,旨在为小家畜胚胎冷冻、解冻和移植提供技术参数。采用OPS冷冻两步法(10%(体积分数)EG 10%(体积分数)DMSO溶液中平衡30 s,移入EDFS30平衡25 s)保存小鼠桑椹胚。一步法解冻是将OPS直接插到盛有0.5mol/L蔗糖的离心管中分别平衡1、2、3、4、5和6 min,解冻后经体外培养结果表明,平衡2~4 min组囊胚发育率(93.58%~97.22%)与对照组(100%)无显著差异(P>0 05);实施两步法解冻时将OPS先后插入0.5和0.25mol/L蔗糖中,体外培养结果显示,先后平衡3和2 min组囊胚发育率(100%)最佳,同对照组无显著差异(P>0.05)。将以上方法管内解冻最佳组的胚胎用OPS管作移植导管,直接移植到受体子宫角中,其妊娠产仔率(38.57%)和管外解冻组(42.86%)及新鲜对照组(51.19%)均无显著性差异(P>0.05)。证明OPS玻璃化冷冻的小鼠桑椹胚可以进行管内解冻和直接移植,为小家畜胚胎移植提供了模型。