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据对虾白斑综合症病毒(WSSV)的基因保守序列,使用Primer Explorer V3软件设计了2条引物,利用PCR的扩增产物,结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术,建立了一种对虾白斑综合症病毒的DHPLC快速检测方法。该检测方法特异性好,与传染性皮下和造血器官坏死病毒、斑节对虾杆状病毒、肝胰腺细小病毒、对虾杆状病毒以及对虾基因组DNA无交叉反应;检测灵敏度较高,约为10-5ng/μL,高于常规PCR及荧光定量PCR的灵敏度。用建立的DHPLC方法对100尾对虾样品进行了临床检测,结果与荧光定量PCR检测结果一致。WSSV的DHPLC检测方法,特异性强、灵敏度高,是对WSSV进行有效检测的一种新方法。 相似文献
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本研究建立了定量检测鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)的微滴式数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)检测方法,并与实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)检测方法的灵敏性、重复性、特异性和临床样品检测做了比较分析.结果表明,与qPCR相比,ddPCR具有相同的特异性,其灵敏性比qPCR低20倍.在定量CyHV-2 DNA时,ddPCR (R2=0.994)和qPCR (R2=0.994)均表现出良好的线性关系,且2种检测方法间的定量值呈正相关(R2=0.989).在定量检测相同稀释度的CyHV-2 DNA时,qPCR的定量值始终比ddPCR高10倍.ddPCR的组内和组间重复变异系数(CV)分别为0.59%-11.26%和6.55%-23.21%,而qPCR为16.57%-27.56%和22.31%-56.73%,说明ddPCR具有更好的稳定性.在临床样品定量检测时,ddPCR的检出率稍高于qPCR.本研究建立的ddPCR能够准确定量检测CyHV-2,将为CyHV-2相关研究提供有益参考. 相似文献
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为获得针对鲤春病毒血症病毒(SVCV)特异性的单克隆抗体(MAb),以纯化的SVCV为抗原,免疫BALB/c小鼠.将免疫鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用间接ELISA法筛选获得4个能稳定分泌抗SVCV MAb的杂交瘤细胞株;4个杂交瘤细胞制备腹水的MAb效价为1:160 000~1:640 000.亚型鉴定结果表明,这些MAb分属2个亚型(1F1、3E1,IgG2a;3F5、4F9,IgGl),轻链均为K链.Western blot分析显示,MAb1F1、3F5、4F9能特异性地识别SVCV的N蛋白(47 ku),3E1能特异性地识别SVCV的G蛋白(69 ku).采用相加ELISA法对抗原表位分析结果显示,1F1、3F5、4F9可能识别相同的表位,3E1则识别不同的表位.间接免疫荧光试验结果显示4株MAb均能对染毒病灶产生特异性的荧光染色.这些MAb的制备为SVCV免疫学检测方法的建立奠定了基础. 相似文献
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本研究通过采用核糖体分型RT、脉冲场凝胶电泳PFGE、多位点序列分型MLST三种方法,对从水生动物中分离到的59株副溶血性弧菌进行分子分型研究。结果将59株副溶血性弧菌分为43个RT型,9个大的聚类群,DI为0.9754;51个PFGE型,13个大的聚类群,DI为0.9988;53个ST型,包括107个新的等位基因、46个新的ST型,DI为0.9982。结果显示PFGE的分辨力最高,MLST较PFGE稍低,RT的分辨力最低。总体来看59株副溶血性弧菌菌株间亲缘关系较远,从同一年份、同一地区、同类样品中分离到的菌株被分为不同的型,表现出较大的遗传多样性。 相似文献
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国内养殖鱼类和进境鱼卵中传染性造血器官坏死病毒(IHNV)的检测及基因分析 总被引:7,自引:0,他引:7
刘荭 范万红 史秀杰 陈超 吕建强 何俊强 高隆英 江育林 LIU Hong FAN Wan-hong SHI Xiu-jie CHEN Chao Lü Jian-qiang HE Jun-qiang GAO Long-ying JIANG Yu-lin 《华中农业大学学报》2006,25(5):544-549
用传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)的反转录聚合酶链及该方法在来自国内养殖场的患病牙鲆和虹鳟及进口的匙吻鲟鱼卵中检测出IHNV,同时对扩增出的IHNV的DNA片段进行了序列分析。结果表明,从国内养殖的牙鲆和虹鳟中分离出的IHNV与IHNV的标准株RB-1株在序列上都具有98.1%的同源性,推导出在氨基酸序列上分别具有97%和99%的同源性。从进口匙吻鲟鱼卵中分离的IHNV与RB-1株在序列上都具有92.5%的同源性,推导出氨基酸序列有93%的同源性。系统发育树分析结果表明,从国内发病的养殖虹鳟中分离出的IHNV与进口匙吻鲟鱼卵中检测到的IHNV在进化上关系较为密切。 相似文献
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患病北极红点鲑的病原分离与鉴定 总被引:1,自引:0,他引:1
对2004年5月四川省某养殖基地养殖的北极红点鲑患病鲑进行了病理学检查和病原分离,从病灶处分离到细菌和真菌。分离到的细菌经API生化鉴定为杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(Aeromonas salmonicidasubsp.salmonicida)。用引物AP1和AP2对纯化后的细菌进行PCR扩增,结果扩增出长度为421 bp的DNA片段,对扩增片段进行克隆、测序,用NCBI-BLASTn在GenBank中搜寻相似序列,结果与杀鲑气单胞菌各株A层蛋白部分编码基因有99%以上的序列同源性。用引物EUS-F和EUS-R对分离到的真菌进行PCR扩增,结果扩增出长度为755 bp的DNA片段,对扩增片段进行克隆、测序,用NCBI-BLASTn在GenBank中搜寻相似序列,结果与水霉属各株的DNA片段(包括18S核糖体RNA基因部分序列、内转录间隔区1全序列、5.8S核糖体RNA基因全序列、内转录间隔区2全序列和28S核糖体RNA部分序列)有93%-100%的同源性;而与属于丝囊霉菌属的EUS各株相对应的DNA片段仅有60%的序列同源性。因此判定所分离的真菌为水霉。杀鲑气单胞菌是引起疖疮病和溃疡病等病的病原菌,而水霉广泛存在于水中,当鱼受伤后,水霉孢子容易从患病部位侵入鱼体,加重感染。因此判断该病主要是由杀鲑气单胞菌引起,而水霉则引起继发感染。 相似文献
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以真鲷虹彩病毒(Red-sea bream iridovirus,RSIV)主要衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)的基因保守片段为靶序列,利用Primer Express 3.0软件设计定量PCR引物,建立了RSIV的SYBR Green I实时定量PCR检测方法.将RSIV MCP基因连接pMD18-T载体,构建重组质粒,经过梯度稀释后作为标准品,根据标准品拷贝数(X)与Ct值的关系绘制了标准曲线,为Ct=-3.184 1gX+40.270,相关系数R2=0.996 9.熔解曲线分析表明,定量PCR产物的Tm值为82.5℃.该方法的检测限为2.20×102拷贝/反应,对流行性造血器官坏死病毒、淋巴囊肿病毒、蛙病毒3、甲鱼虹彩病毒都没有扩增反应,具有特异性.利用该方法对84批海水鱼类(石鲽、大菱鲆、鲈鱼)进行检测,其中5批鱼样品感染RSIV,并利用标准曲线对病毒含量进行了定量分析. 相似文献
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流式细胞仪在快速测定鲤春病毒血症病毒滴度中的应用 总被引:1,自引:0,他引:1
本研究建立了流式细胞仪快速检测鲤春病毒血症病毒(spring viraemia of carp virus,SVCV)滴度的方法。运用荧光激活细胞分选(fluorescence-activated cell sorting, FACS)技术检测SVCV A1株对草鱼性腺细胞系(GCO)的感染情况。用SVCV病毒单克隆抗体为一抗,FITC标记的羊抗鼠抗体为二抗,运用FACS来检测感染后不同时间点,以及不同病毒接种量的阳性细胞率。感染第3天时为最佳的病毒滴度测定时间点,测得SVCV的病毒滴度为8.31×105 FIU/mL,最低检测病毒滴度为(1000 FIU/mL),与传统空斑试验(plaque assay,PA)相比,两种方法测得的结果基本一致。实验结果表明,FACS是一种简捷、高效、直接的检测SVCV滴度的方法,是一种新型的病毒滴度测定方法。 相似文献