家蚕同源异型结构域蛋白基因Bmvis的克隆及组织表达和亚细胞定位

同源异型结构域蛋白(homeobox,HOX)基因是对生物体的生长发育从时间和空间上进行调控的一类基因。Vis(vismay)属于同源异型结构域蛋白转化生长影响因子(transforming growth interacting factor,TGIF)家族成员,在脊椎动物的研究中表明TGIF是转化生长因子-β(transforming growth factor β,TGF-β)信号转导途径中的转录抑制子,但在果蝇(Drosophilamelanogaster)的研究中发现其是一种转录激活子。基于为探究家蚕(Bombyx mori)中vis基因的功能提供基础信息的目的,在电子克隆的基础上通过RT-PCR从家蚕5龄幼虫精巢cDNA中克隆了长度为847 bp的vis基因(Bmvis)片段(GenBank登录号:JF412700)。蛋白结构分析表明Bmvis在HOX结构域的螺旋区和TALE区段内高度保守,同时在HOX结构域外的C末端大约20个氨基酸也是高度保守的。进化分析显示昆虫的Vis与Achi(achintya)聚为一类,但Vis与Achi根据物种分类关系聚在一起。对Bmvis在家蚕5龄第3天幼虫组织中表达的RT-PCR检测显示其仅在精巢中表达。将Bmvis进行原核表达后获得抗Bmvis多克隆抗体,亚细胞定位显示Bmvis在细胞核和细胞质中均有表达,但主要分布在细胞核中。     

家蚕丝素蛋白H链基因启动子区域的克隆及活性分析

家蚕(Bombyxmori)丝素蛋白H链基因(fib-H)具有在后部丝腺组织专一性、高效性表达的特点。为利用其时空调控机制,通过PCR扩增方法克隆fib-H启动子片段,并进行序列分析,进而构建由fib-H启动子控制报告基因DsRed的重组载体pSK-FH-DsRed-PolyA,通过家蚕BmN细胞和丝腺进行瞬时表达。结果表明:克隆的fib-H启动子序列具有典型的丝腺特异性表达启动子的特征,并可以驱动DsRed报告基因在BmN细胞和家蚕后部丝腺组织中瞬时表达。     

家蚕核型多角体病毒p35基因的核苷酸序列分析

对家蚕核型多角体病毒苏州株 (BmNPVsu)p35基因的序列分析表明 :BmNPVsup35编码序列为 897nt,编码 2 98aa。同源性分析表明 :BmNPVsup35与BmNPVT3、AcNPV、SlNPV在核苷酸水平上同源性分别为 99.5%、95.1 %、89.3% ,在氨基酸水平上的同源性分别为 98.7%、89.4 %、76.4 % ,显示了杆状病毒p35基因在进化上的保守性。BmNPVT3中位的N14 6、S2 0 2 、E2 0 4 、K2 4 4 ,在BmNPVsu中分别被G、N、Q、N取代 ,BmNPVT3中S2 2 2 ,在BmNPVsuP35中发生了缺失。推测BmNPVsuP35蛋白的功能及抑制细胞凋亡的能力与BmNPVT3P35蛋白的相似     

池塘养殖大银鱼子代生长的初步研究

通过对池塘养殖大银鱼子代的一年生长实测和统计，得到结果如下：（１）子代大银鱼在 养殖也能迅速生长，经１０个月饲养，平均长达１１７．９２ｍｍ，平均体重８．５０ｇ；（２）体长与体重的关系为Ｗ＝１．３０４×１０＾－６Ｌ＾３．２９３；（３）大银鱼生长与池中适口饵料数量有关。     

维氏气单胞菌感染异育银鲫基因表达谱分析

[目的]探讨异育银鲫在维氏气单胞菌感染的条件下肾脏组织基因表达谱。[方法]运用RNA-sequencing技术分析健康和感染维氏气单胞菌的异育银鲫肾脏组织中mRNA表达水平的变化。[结果]通过比较维氏气单胞菌感染组与健康对照组异育银鲫肾脏组织基因表达的差异,发现维氏气单胞菌感染后11 567个基因表达水平发生了显著变化,其中5 634个基因表达水平发生上调,5 933个基因表达水平发生下调。对所有差异表达基因(DEGs)进行功能注释(GO)分析,发现1 325个DEGs含有GO注释,其中上调和下调表达基因分别为581和744个;GO注释结果显示,上调表达基因主要富集于RNA指导的DNA聚合酶活性、Ⅱ型特异性脱氧核糖核酸酶活性、内切酶活性等;下调表达基因主要富集于吡哆醛结合、肽酶抑制剂活性和RNA指导的DNA聚合酶活性等。对所有DEGs进行KEGG通路分析,发现545个DEGs(215个上调表达基因,330个下调表达基因)含有KEGG注释;上调表达基因主要富集于内质网中的蛋白质加工、抗原加工和呈现和雌激素信号通路等KEGG通路;下调表达基因富集通路主要富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用...     

利用非转座子载体介导的转基因家蚕表达人胰岛素样生长因子Ⅰ

为了实现利用非转座子载体介导的转基因家蚕整体表达人胰岛素样生长因子Ⅰ(hIGF-Ⅰ),将hIGF-Ⅰ基因克隆进非转座子类型的昆虫细胞表达载体pIZT/V5-His,构建转基因载体pIZT/V5-His-hIGF-Ⅰ。利用精子介导法将该转基因载体导入家蚕卵,通过绿色荧光筛选并结合PCR和Dot blotting检测鉴定,表明已成功获得hIGF-Ⅰ转基因家蚕。对培育至G2代的转基因家蚕5龄幼虫蛋白质样品进行Western blotting分析,结果显示hIGF-Ⅰ在转基因家蚕中获得表达,重组hIGF-Ⅰ的分子质量约12.5 kD;ELISA检测hIGF-Ⅰ在G2代转基因家蚕5龄幼虫全蚕以及后部丝腺、脂肪体冻干粉中的质量比分别为65、411、469 ng/g。试验结果再次证实通过非转座子载体pIZT/V5-His介导可以将外源基因导入家蚕基因组,并实现外源基因在转基因家蚕中整体表达。     

SARS-COV S蛋白在大肠杆菌和家蚕中的表达

将SARS-CoV S蛋白基因的部分序列(accession number为AY304495的22 908-23 542 nt区域),克隆到表达载体pET28 a(+)中,并在大肠杆菌BL21中诱导表达。SDS-PAGE、W estern b lotting分析表明,重组S蛋白的分子量约为27 kD,与理论分子量相符。将S蛋白基因的部分序列克隆入杆状病毒转移载体pBacPAK-H is后,与线性化家蚕杆状病毒BmBacPAK-6共转染BmN细胞,经空斑筛选获得重组杆状病毒BmBac-S,并将其在细胞和家蚕中进行表达。SDS-PAGE、W estern b lotting分析表明,表达产物的分子量约30 kD,用金属螯合亲和层析纯化得到家蚕细胞表达的重组S蛋白。     

ie-1和lef-1基因dsRNA表达元件转染及转化细胞对家蚕核型多角体病毒增殖的抑制

通过RNAi介导可以抑制病毒增殖,将相应的RNAi元件通过转基因转入宿主有可能使宿主对病毒产生一定的抗性。根据家蚕核型多角体病毒(BmNPV)基因组中的病毒复制必需基因ie-1、lef-1设计相应的RNA干扰区段,并构建相应的转基因载体转入家蚕BmN细胞中,瞬时表达结果显示转染了转基因RNAi载体的BmN细胞均对BmNPV有一定的抑制作用。IE dsRNA在病毒滴度为10-4时有抑制作用,在病毒滴度为10-5时有比较好的作用;LEF dsRNA则在病毒滴度为10-5时有抑制作用,在病毒滴度为10-6时有较好的抑制作用。通过转基因及G418筛选后,转基因IE dsRNA细胞在病毒滴度为10-4显示出一定的抑制作用,在病毒滴度为10-5表现了明显的抑制作用;而转基因LEF dsRNA细胞在病毒滴度为10-5有一定的抑制作用,但只维持了一个时段。     

利用家蚕表达合成人表皮生长因子(EGF)及产物对胃粘膜损伤的修复作用

基于家蚕杆状病毒密码子的偏爱性,对人表皮生长因子基因(hEGF)的部分密码子进行修改后合成一个新的基因,命名为CSEGF。所合成的CSEGF能编码同hEGF完全一致的氨基酸序列,并被重组进家蚕杆状病毒获得重组Bm-BacCSEGF。重组病毒感染家蚕后,该基因在家蚕中的表达量达28.4μg/mL幼虫血淋巴及33.07μg/mL蛹血淋巴。将表达CSEGF的蚕蛹经冻干直接制成EGF冻干粉胶囊,经测定冻干粉中EGF的质量比达140μg/g。动物模型试验显示该冻干粉对酸诱导的急性胃粘膜损伤的SD大鼠有显著的修复作用,对大鼠裸鼠的肾细胞生长也有明显的促进作用。     

家蚕蛹虫草对小鼠免疫调节的影响

以小鼠为试验动物 ,对家蚕蛹虫草的免疫调节作用进行了研究。结果表明 ,家蚕蛹虫草无增加小鼠血清溶血素抗体积数作用 ,但可提高腹腔巨噬细胞的吞噬率 ,对二硝基氟苯 (DNFB)诱导的小鼠迟发型变态反应无增强作用 ,可显著提高小鼠NK细胞的活性 ,对小鼠体重及小鼠脏器 /体质量的比值无影响 ,表明家蚕蛹虫草具有免疫调节作用。