牙鲆脑垂体早期发育的组织学观察

垂体作为鱼类最重要的内分泌器官之一,在生长、发育、生殖以及其他一些内分泌相关生理活动中起重要作用。作者采用组织学方法观察了牙鲆的脑垂体发生,对不同发育时期的腺垂体细胞进行了初步鉴定。结果表明,孵化后1d仔鱼的间脑下方可见一实心细胞团,于孵化后3d迁移至间脑后方的漏斗体下,与来自漏斗体的神经内分泌细胞及其神经纤维结合共同形成脑垂体,前者形成腺垂体,后者则主要形成神经垂体。孵化后8d腺垂体分为中间部(Pars intermedia,PI)和外侧部(Pars distalis,PD)两部分。孵化后14d腺垂体分化为前外侧部(Rostral pars distalis,RPD)、中外侧部(Proximal pars distalis,PPD)和PI共3部分,为"前后型"脑垂体。稚鱼变态期间及变态完成后的幼鱼,各部分从"前后型"排列开始向"背腹型"排列转变。孵化后14d的牙鲆仔鱼中,PPD细胞多呈强嗜酸性,至变态完成后一直是PPD的主要细胞;PI靠近神经纤维的细胞呈强嗜碱性。孵化后42d的牙鲆幼鱼RPD中,与神经垂体相邻的少量细胞呈嗜碱性,而其下方细胞则呈嗜酸性。根据成体牙鲆激素分泌细胞的染色特征对上述各细胞类型进行了推测。     

牙鲆(Paralichthys olivaceus) Activin 基因两种β亚基的启动子克隆及生物信息学分析

以牙鲆为研究对象,利用染色体步移(Genome walking)获得了 Activin 两个β亚基基因的上游部分启动子序列,并对其进行了转录调控元件的生物信息学预测分析。获得了 Activin βA 和βB两个亚基的启动子部分序列,长度分别约为2.7 kb 和2.4 kb;在预测的 Activin βB 转录起始位点(+1位)的上游31 bp 处有1个典型的 TATA box,而在 Activin βA 中未发现 TATA box 的存在。两个基因的启动子上发现了多个转录因子 Sp1、Oct-1、C/EBP、CREB、GATA-1、HNF-3、HNF-1、USF 等结合位点,还发现了与内分泌相关的 Pit-1、ER、PR、GR、RAR、RXR 等结合位点,但肌性转录因子 MyoD、myogenin 和雄性的性别决定基因 SRY 结合位点仅在 Activin βA 启动子中发现。生物信息学分析显示,牙鲆 Activin βA 和βB 表达受到多种潜在因子的调控,二者在调控上有所差异。     

3月龄牙鲆形态性状对体质量的通径分析

随机选取3月龄牙鲆Paralichthys olivaceus100尾,分别测量全长(X1)、体长(X2)、头长(X3)、体厚(X4)和体高(X5)共5个形态学指标和体质量(Y)。通过SAS软件进行相关性分析和回归分析,分别计算以形态性状为自变量对体质量的通径系数和决定系数,进而对各性状对体质量的影响进行剖分。明确影响3月龄牙鲆体质量的主要形态性状,为牙鲆选育提供数据支持和理想的测度指标。结果表明,各形态性状间及与体质量的相关系数均达到极显著(P0.01)。体长、体厚和体高对体质量的通径系数均达到极显著的水平(P0.01);所选形态性状对体质量的决定系数R2=0.945,表明所选形态性状是影响3月龄牙鲆体质量的主要性状。通过对各形态性状偏回归系数的显著性检验,剔除不显著的性状自变量后,建立最优的多元回归方程:Y=-4.988+0.763X2+2.997X+1.089X,各偏回归系数均达到极显著水平(P0.01)。     

圆斑星鲽胚胎及仔鱼发育的观察

对圆斑星鲽(VeraspervariegatusTemmincketSchlegel)胚胎及胚后发育进行观察,描述了各发育时期的形态特征和发育速度。在水温为(11±0.5)℃时,受精卵历时153h脱膜孵出,孵化后仔鱼在水温为(15±0.5)℃时经过6d开口摄食,50d完成变态而成幼鱼。圆斑星鲽的卵子为半浮性卵,其卵黄量很多。卵裂后期,卵裂球的大小和卵裂速度均出现差异。眼泡在体节形成之前出现。刚孵化仔鱼消化道细而直,孵化5d肛门打通,6d开口。随着卵黄囊的消失,消化道开始弯曲。色素细胞首先出现在86h的胚体中,至140h在卵黄囊上零星分布,且随着胚体发育,色素细胞增多,至变态完成后全身密布黑色色斑。胚体色素细胞的形状由孵化前的雪花状逐渐变为圆形,但卵黄囊上的色素细胞始终为雪花状。     

牙鲆鳃细胞系染色体组型的变异分析

对传代296次的牙鲆（Paralichthys olivaceus）鳃细胞系（FG）进行染色体制备和组型分析,并与牙鲆活体鳃细胞组型进行比较。牙鲆活体鳃细胞染色体数目为48,且均为端部着丝粒染色体,染色体组型公式为2n=48,48t,NF=48。而鳃细胞系的染色体数目出现较大变化,有两个分布区问,一个区间是53～79;另一个是119～139。其模式染色体数为68,在模式细胞分裂相中,有30对端部着丝粒染色体和4对中部着丝粒染色体;染色体条数在119以上的分裂相中,除了有很多中部着丝粒染色体以外,小染色体也以很高的频率出现。通过上述研究分析表明,牙鲆鳃细胞系经多次传代后,其染色体与活体鳃细胞染色体相比存在着明显的差别,已经发生了变异,不适合用于牙鲆染色体核型、组型等方面的研究。[中国水产科学,2008,15（3）：483-487]     

病毒性出血性败血症病毒单链抗体的原核表达及其功能鉴定

为制备病毒性出血性败血症病毒(VHSV)单链抗体(single chain variable fragment antibody,ScFv)并鉴定其生物学功能,本研究提取抗VHSV单抗1G5的杂交瘤细胞株总RNA并反转录获得cDNA模板,通过PCR扩增VHSV抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)编码序列,将其拼接成单链抗体Sc Fv基因后插入载体pET28a中,构建原核表达重组质粒并在大肠杆菌中诱导表达。结果表明,单链抗体主要以可溶性形式表达,分子量约28 ku,能特异性识别VHSV病毒的G蛋白并对VHSV病毒具有体外中和活性,其对VHSV病毒的G蛋白亲和力(KD)达到1.4×10~(–8) M。单链抗体ScFv的制备为进一步研究VHSV的治疗性抗体、快速诊断试剂奠定了基础。     

牙鲆微卫星标记的筛选及群体多态性分析

以牙鲆（Paralichthys olivaceus Temminck et Schlegel）为材料，基因组DNA经Sau3A Ⅰ进行部分酶切后，选取400～1200bp大小的片段连接到经BamH Ⅰ酶切的pUC19质粒中，连接产物转化大肠杆菌DH5a，构建牙鲆酶切片段基因组文库。采用菌落杂交的方法，以（AC）10、（AG）10为探针从文库中筛选阳性克隆16个，共得到20个微卫星序列，其中完全型13个，不完全型5个，复合型2个。对其中18个进行引物设计，有11对引物扩增出目的片段，其中8对引物在群体中具有扩增多态性。在威海野生牙鲆30个个体中，各座位上得到的等位基因数为4～19个，观测杂合度（Ho）为0．4138～0．9655。其中有3对引物扩增的等位基因数超过17个，表现出高度多态性。本研究旨为进一步的牙鲆遗传多样性分析、家系分析及遗传图谱的构建等提供基础依据。     

大菱鲆胚胎和仔稚鱼的热刺激耐受能力

以培育大菱鲆Scophthalmus maximus耐高温品系为目的,研究了胚胎和仔稚鱼对热刺激的耐受力差别,为通过高温刺激选育大菱鲆耐高温品系提供指导和基础数据。实验分别对大菱鲆胚胎期(孵化前期)、卵黄囊期(初孵仔鱼,0dph)、前弯曲期(10dph)和弯曲期(25dph)的仔鱼、稚鱼(50dph)使用22～33℃范围内不同梯度的高温海水,进行突变热刺激,2h后转入原水体中培育,记录之后60～84h的死亡率、仔鱼孵化率、畸形率等数据。结果表明,上述5个发育期大菱鲆经受2h热刺激的亚致死温度为24、23、<22、28、28℃,半致死温度为26、28、22、29、29℃,致死温度为30、29、27、30、30℃。根据热刺激后24和48h死亡率,耐热能力由弱到强依次为10dph<胚胎<0dph<25dph<50dph,总体上呈现随生长发育逐渐增强的趋势。10dph左右可能为大菱鲆热刺激耐受力低谷,此时也是开鳔期,对外界环境反应灵敏,受到不良环境刺激易导致死亡。     

牙鲆JNK2基因的表达分析及免疫功能探究

本研究利用实验室已建牙鲆(Paralichthys olivaceus)转录组数据库,得到牙鲆JNK2基因(PoJNK2)并利用PCR技术进行序列验证。PoJNK2的开放阅读框长度为1263 bp,编码420个氨基酸;通过SMART服务器对PoJNK2的结构域进行预测,显示PoJNK2具有典型的丝氨酸?苏氨酸蛋白激酶催化结构域S_TKc。利用qRT-PCR分析PoJNK2在牙鲆成体不同组织中的表达水平,发现其在牙鲆免疫组织中均有表达,因此,初步推测PoJNK2在牙鲆免疫应答方面可能发挥作用。本研究设计了体内迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)侵染实验和体外免疫刺激细胞实验以探究PoJNK2在牙鲆免疫反应中的作用。在迟缓爱德华氏菌体内注射牙鲆成体后,PoJNK2在脾脏、头肾和鳃中有不同程度的表达上调。同时,使用迟缓爱德华氏菌、Poly I:C和肿瘤坏死因子-α (TNF-α)刺激牙鲆鳃细胞系后,发现PoJNK2在不同时间点表达上调。除此之外,通过细胞转染实验在牙鲆鳃细胞系中过表达PoJNK2,发现其对下游炎症细胞因子的表达及激活蛋白Activator protein-1 (AP-1)的转录活性具有显著的上调作用,进一步阐明了PoJNK2在调节牙鲆免疫应答方面的作用。     

牙鲆（♀）×圆斑星鲽（♂）杂交子代的胚胎及仔鱼发育

以牙鲆(Paralichthys olivaceus)为母本,圆斑星鲽(Verasper variegatus)为父本进行科间远缘杂交,观察和记录了杂交受精卵胚胎及胚后仔鱼的发育情况,描述了各时期的形态特征。杂交受精卵为浮性卵,其受精率和孵化率分别为(71.18±0.14)%和(61.65±0.19)%,胚胎发育的畸形率为(17.00±0.06)%,4日龄仔鱼出苗率为(58.63±0.19)%,35日龄仔鱼的成活率为(57.08±0.20)%。在水温为(15±0.5)℃、海水盐度为29~30的条件下,受精卵经74 h孵化。孵化后4 d开口摄食,17 d开始变态,35 d完成变态。变态时,37%的仔鱼向右偏转,63%的仔鱼向左偏转。结果表明,牙鲆和星鲽杂交不存在配子不亲和,受精卵可以正常发育,杂交子代可以正常成活和生长。本研究旨为下一步杂交育种奠定基础。