利用二代测序技术对柔嫩艾美耳球虫T-DNA整合位点的分析及鉴定

为建立一种适用于转基因球虫的快速且准确的分析T-DNA整合位点的方法,本研究利用二代测序技术对转基因柔嫩艾美耳球虫EtM2e虫株进行基因组重测序分析,基于嵌合体reads比对分析T-DNA的插入位点,通过T-DNA特有序列以及外源基因与球虫同源序列的测序深度进而分析T-DNA拷贝数,最后利用PCR扩增验证分析位点。结果表明:1)二代测序下机数据过滤后获得数据7.2 Gb,Q20为96.1%,Q30为89.2%,能够比对至柔嫩艾美耳球虫参考基因组的reads数为23 992 361×2,平均测序深度为80×,reads全基因覆盖结果表明整个染色体被覆盖的较为均匀,测序的随机性比较好,可以进行后续分析;2)比对至T-DNA序列的reads数为3 106和3 036,平均测序深度为140×,嵌合体reads序列信息表明T-DNA只存在一个插入位点,位于HG994969.1:2 704 213~2 705 255;3)T载体骨架特有序列卡那抗性基因的平均测序深度为67×,T-DNA特有序列EYFP基因的平均测序深度为85×,而T-DNA与球虫同源序列His4基因的5′调控区序列的平均测序深度为154×,Actin基因的3′调控区序列的平均测序深度为164×,同源序列的平均测序约为特有序列平均测序深度的2倍,这表明T-DNA为单拷贝,与发现一个插入位点的结果相符合;4)经PCR验证分析成功鉴定了该整合位点。转基因艾美耳球虫EtM2e虫株T-DNA整合位点的鉴定为后续转基因球虫鉴定提供了技术平台,也为球虫活载体疫苗的研发提供了一个潜在的靶位点。