温度对稀释活菌苗菌存率的影响

20％铝胶生理盐水稀释B_(26)—T_(1200)禽霍乱弱毒冻干菌,在?7℃的环境中,活菌死亡最迅速,放置6小时4/4组苗菌存率(活菌数)都下降到30.3％～13.6％之间,12小时4/4组苗菌存率都低于10％,24小时菌存率4/4组都已低于1％。22℃温度中,活菌减少速度有所减慢,放置6小时4/4组菌存率都在56.5％～88.1％之间,12小时4/4组菌存率都低于40％,24小时4/4组菌存率都低于13.7％。4℃冰箱放置菌液,活菌死亡速度相对最慢,6小时4/4组菌存率都高于82.5％,24小时4/4组菌存率仍在51.4％～75.3％之间。活菌存活率取决于菌液保存温度和时间。     

应用RAPD技术分析禽多杀性巴氏杆菌广西分离株的DNA多态性

应用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术，以随机引物单条或成对组合的方式对9株禽巴氏杆菌(PM)广西分离株和3个参考株的DNA进行了多态性分析。结果显示，在选用的20个引物中，有4对引物(4条引物成对组合)扩增的条带为1～16条，其长度在90～2600bp。相似指数分析显示，PM广西分离株GX2与GX4的相似指数最高，为0．97；GX7与B26T1200的相似指数最低，为0．21，C48—1标准强毒株与PM广西分离株间的相似指数为0．33～0．64。表明广西当地的流行株呈现多样性，与PM标准强毒株存在差异。     

对虾WSSV和IHHNV多重PCR检测试剂盒的研究与应用

在对虾白斑综合征病毒(WSSV)和传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)二温式PCR检测技术前期研究的基础上,将这2种病原的特异性引物与PCR基础反应液一起组装成快速检测试剂盒。通过对试剂盒敏感性、稳定性和保存期等技术指标的测定以及对临床样品的检测试验,该试剂盒对同一样品中的WSSV和IHHNV DNA模板均能特异性地扩增出2条与实验设计相符的593 bp(WSSV)和356 bp(IHHNV)的DNA片段,而对其它对虾病原的扩增结果均为阴性;该试剂盒最低能检测到102pg的WSSV DNA和10 pg的IHHNV DNA。对WSSV和IHHNV DNA的检出量分别为102~103pg和10~102pg。     

贝类单孢子虫和折光马尔太虫二重PCR检测方法的建立

根据基因库中单孢子虫和折光马尔太虫的基因序列,分别设计了2对特异性引物,通过对二重PCR扩增条件的优化,研究建立了可同时检测鉴别这2种原虫的二重PCR。对同一样品中的单孢子虫和折光马尔太虫模板DNA进行扩增,得到2条大小与试验设计相符的244 bp(单孢子虫)和478 bp(折光马尔太虫)的特异性扩增带,而对派琴虫、嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌等病原体的检测,结果均为阴性。敏感性试验表明,该技术最低能检测到10 pg的单孢子虫和折光马尔太虫DNA。     

H5N1亚型AIVHA抗原表位的高效表达及其抗原活性分析

血凝素（hemagglutinin,HA）蛋白是禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）的一个重要表面抗原性蛋白,在疾病诊断和防治上有重要意义。本研究为了探讨一种更为简便有效的HA重组蛋白表达途径,利用生物信息学软件,对H5N1亚型AIVHA基因编码的氨基酸序列进行分析,在分析其在大肠杆菌中的密码子偏好性、稀有密码子分布情况及有关蛋白的抗原性等重要特性后,构建了HA抗原表位重组表达质粒pET-32a（＋）-HA。经测试,该重组质粒在1mmol/LIPTG诱导剂作用下诱导过夜,能在大肠杆菌Rosetta-gami B（DE3）中高效表达,并得到48.1kD大小的目的重组表达蛋白。重组蛋白用6×His-tagged protein纯化试剂盒纯化后,与福氏佐剂等量混合制备成抗原,以200μg/鸡的剂量皮下注射2月龄SPF鸡3次,采血分离血清。Western-Blot试验结果表明,该重组表达蛋白能分别与所制备的高免鸡血清及H5N1亚型AIV阳性血清发生特异性反应,在硝酸纤维素膜上出现特异性杂交带。说明本试验研究的HA抗原重组表达蛋白具有良好的免疫原性和反应原性,保留了HA蛋白的抗原活性,提示该重组蛋白在H5亚型AIV的防治技术研究中具有重要的实际应用价值。     

I群禽腺病毒间接33K-ELISA检测方法的建立

【目的】建立一种鉴别I群禽腺病毒（FAVI）灭活苗免疫和野毒感染的检测方法,为FAVI的防控与净化提供技术支撑。【方法】以FAVI 33K重组蛋白为包被抗原,筛选和优化间接ELISA的条件,建立FAVI抗体的间接33K-ELISA检测方法,检验其特异性、敏感性和重复性,并鉴别检测FAVI活病毒感染血清和灭活苗免疫血清各50份。【结果】33K重组抗原最佳包被浓度6.0 μg/mL,包被条件为37℃孵育1 h后4℃过夜,最佳封闭液为5%脱脂奶,封闭时间1.0 h;待检血清稀释度1∶100,抗原抗体最佳作用时间1.0 h;酶标二抗最佳稀释度1∶3000,作用时间45 min。优化后的间接33K-ELISA的阴、阳性临界值为0.316。其特异性、敏感性、重复性试验及鉴别检测结果表明,优化后的间接33K-ELISA具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点,且能成功鉴别FAVI感染与灭活疫苗接种。【结论】间接33K-ELISA操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性好、适于批量检测,可有效鉴别FAVI感染和灭活苗免疫接种,利于挑选出FAVI感染动物,为FAVI的防控与净化提供了新思路和新方法。     

鸡新城疫病毒和禽肺炎病毒二重RT-PCR检测方法的建立及应用

[目的]建立一次性可同时扩增鉴别鸡新城疫病毒(NDV)和禽肺炎病毒(APV)的二重RT-PCR,为有效防控鸡新城疫和禽肺炎病毒病提供技术支持.[方法]根据GenBank已发表NDV的F基因序列(GenBank登录号JX840454)和APV的F基因序列(GeneBank登录号AF187154)分别设计2对特异性引物,应用这2对引物建立可同时检测鉴别NDV和APV的二重RT-PCR,对扩增条件进行优化,并通过特异性试验、敏感性试验和临床样品检测等验证其实用性.[结果]优化后的二重RT-PCR可特异性扩增出参试NDV毒株(LaSota株、F48E9株、I株)及APV/MN-10毒株的目的条带,其大小分别为247和424 bp,而其他对照参试毒株在247和424 bp处均无特异条带出现.二重RT-PCR针对NDV和APV的最低检出限均为10 pg的RNA.应用建立的二重RT-PCR对132份从广西采集的病鸡样品进行检测,结果得到NDV阳性样品26份、APV阳性样品2份,与血清学方法的鉴定结果一致.随机选取的2份NDV阳性PCR产物与NDV(GenBank登录号JX840454)的F基因序列一致,同源性达100%;2份APV阳性PCR产物与APV(GenBank登录号AF187154)的F基因序列也完全一致,同源性达100%.[结论]针对NDV和APV建立的二重RT-PCR具有特异性好、灵敏度高、简便快速的特点,可用于临床快速鉴别诊断,为有效防控鸡新城疫和禽肺炎病毒病提供了技术支持.     

贝类单孢子虫荧光定量PCR检测方法的建立

根据基因库中单孢子虫的基因保守序列,设计了1对特异性引物和1条TaqMan探针,对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了检测单孢子虫的荧光定量PCR方法。该方法对单孢子虫的检测敏感性达到40拷贝数,比常规PCR敏感性高100倍;对派琴虫、折光马尔太虫、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌等病原体的检测结果全为阴性。表明该研究建立的单孢子虫荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量和重复性好等优点,可用于临床单孢子虫感染的快速检测。     

罗非鱼荧光假单胞菌的分离鉴定

从发病罗非鱼中分离获得1株革兰氏阴性杆菌,依据细菌形态、培养、生理生化特性初步鉴定为荧光假单胞菌,结合PCR检测、克隆测序及Blast比对分析,进一步确定该分离菌株为荧光假单胞菌。致病性试验结果显示,该分离菌株具有较高的致病性,能引起罗非鱼发病、死亡,其病理变化与荧光假单胞菌引起的鱼类赤皮病完全相似。药敏试验结果显示,该分离菌株对氟哌酸、氧氟沙星、新霉素高度敏感,但对氨苄青霉素、青霉素、阿莫西林等不敏感。     

H5亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测技术的建立

【目的】建立一种适用于H5亚型禽流感病毒（AIV）的逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）可视化快速检测技术,为控制疫情扩散、减少经济损失争取了时间。【方法】根据GenBank中H5亚型AIV血凝素（HA）基因序列,设计一套针对HA基因6个区域的4条特异性引物,在反应之前向反应液中加入荧光试剂（Calcein／MnCl2混合液）,然后对反应条件和体系进行优化。【结果】优化的RT-LAMP技术操作简便迅速,常规水浴锅中50min可完成,能特异性地检测出H5亚型AIV,但对其他HA亚型AIV、禽呼吸道病原体无交叉扩增反应,灵敏度是常规RT-PCR的10倍;反应结束后无需打开反应管盖,即可根据反应液的颜色变化对结果进行判定。【结论】建立的H5亚型AIVRT-LAMP可视化检测技术具有简便、快速、特异等特点,可在设备有限的基层兽医站及养殖场对H5亚型AIV进行快速初步诊断。