猪流行性腹泻病毒和猪圆环病毒4型双重SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

分别靶向猪流行性腹泻病毒(PEDV) M基因和猪圆环病毒4型(PCV4)ORF2基因,合成了2对特异性引物,建立了同时检测PEDV和PCV4的双重SYBR GreenⅠ荧光PCR检测方法。结果显示,PEDV和PCV4在一个反应体系中出现明显不同的熔解峰(Tm),PEDV的Tm值为84℃,PCV4的Tm值为79℃,而对其他常见的非靶标猪病毒没有显示特定的熔解峰,且对于PEDV和PCV4的最低检测极限分别为55.2,44.1拷贝/μL。利用本研究建立的双重荧光PCR方法对30份猪临床样品进行检测,结果显示,PEDV和PCV4的检出率分别为40%(12/30)和60%(18/30),PEDV和PCV4混合感染的检出率为33%(10/30),相较于常规PCR方法更加灵敏。该方法能够同时对PEDV和PCV4进行检测,极大地提高了检测效率和准确度,为PEDV和PCV4的诊断与防控提供技术支持。     

程序性死亡分子1胞外区的表达及其 抗血清对PCV2增殖的影响

为研究猪的程序性死亡分子1（PD-1）胞外区参与猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2, PCV2）感染的免疫调节功能,PCR扩增健康猪舌组织中PD-1胞外区,构建重组表达质粒pET-28a-PD-1,转化至Rosetta（DE3）。经IPTG 诱导表达后,采用SDS-PAGE和Western Blot 检测重组PD-1胞外段蛋白 exPD-1表达情况。结果显示,重组菌pET-28a-PD1/ DE3,在37 ℃、0.5 mmol·L^-1 IPTG诱导8 h时,exPD-1蛋白的表达量最高,大小约为20 kDa,且以包涵体形式表达。然后将经纯化和复性获得的exPD-1辅以佐剂免疫新西兰兔,制备兔抗exPD-1血清,经Western Blot检测结果显示该抗血清具有较好的反应原性。用PCV2感染猪肾（Porcine kidney-15,PK-15）细胞,采用荧光定量PCR检测PD-1转录水平,结果显示PCV2感染PK-15细胞1 ~ 48 h时PD-1的mRNA转录水平均下调;用兔抗exPD-1血清处理PK-15细胞后感染PCV2,PD-1的转录水平显著上调（P < 0.01）,且明显地抑制了PCV2的复制（P < 0.01）。上述结果表明,在体外PCV2感染可引起PD-1转录水平下调,兔抗exPD-1血清可通过封闭PD-1/PD-L1通路,抑制PCV2增殖。     

猪伪狂犬病病毒和猪圆环病毒3型双重SYBR GreenⅠ 荧光定量PCR方法的建立

为了同时检测猪伪狂犬病病毒（PRV）野毒和猪圆环病毒3型（PCV3）,基于PRV gE基因和PCV3 Rep基因保守序列各合成了1对引物,在优化反应体系和扩增条件的基础上,建立了检测PRV和PCV3的双重SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法。结果显示：PRV和PCV3的Tm值分别为87和81.5 ℃,能特异地检测PRV和PCV3,而对其他5种猪病原均未检测到荧光信号;PRV和PCV3的最低检测值分别为37.0和33.8 copies·μL^-1;批内批间变异系数均小于2%;对2017—2019年期间采自河南地区的78份猪临床样品进行检测,PRV和PCV3的阳性率分别为19.23%（15/78）和41.03%（32/78）,二者混合感染的阳性率为8.97%（7/78）。表明该方法具有高度的敏感性、特异性和稳定性,可用于监测PRV野毒和PCV3及其流行病学调查。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒4型双重SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

分别靶向PRRSV ORF7基因和PCV4 ORF2基因的高度保守区,设计了2对特异性引物,建立了同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒4型(PCV4)的SYBR GreenⅠ-based双重实时荧光定量PCR方法。PRRSV和PCV4在同一样品中的区别在于它们独特的熔解温度(Tm),PRRSV为84.5℃,PCV4为79.0℃,而对其他非靶向的猪常见病毒没有显示特定的熔解峰,且检测极限分别为PRRSV的81.5 copies/μL和PCV4的41.1 copies/μL。采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR和常规PCR方法对30例有呼吸和繁殖衰竭症状的猪临床样本进行检测,检测结果显示,PRRSV阳性率为20.0%(6/30),PCV4阳性率53.3%(16/30),且PRRSV阳性样品中PCV4检出率为50.0%(3/6),较常规PCR检测更灵敏。该方法可能是检测PRRSV和PCV4共感染的一种快速、灵敏和可靠的方法。