盐穗木HcGKR基因亚细胞定位表达载体的构建及定位分析

[目的]以GFP基因为报告基因,构建HcGKR基因的亚细胞定位表达载体.[方法]采用PCR方法和基因枪法.[结果]用PCR法,以pGEM- T- HcGKR质粒为模板,获得HcGKR基因的目的片段.然后将其克隆到亚细胞定位表达载体35S:GFP中,获得由CaMV35S启动子调控目的基因的35S - GFP - HcGKR融合表达载体,使目的基因能够和GFP融合同时表达.采用基因枪法将35S - GFP - HcGKR转化到洋葱表皮细胞中,暗培养24 h后,经共聚焦显微镜观察确定发出绿色荧光的位置,对HcGKR基因进行亚细胞定位.[结论]构建的亚细胞定位表达载体可在植物细胞中表达,通过洋葱细胞中绿色荧光的位置确定目的基因定位在细胞膜上,为进一步盐穗木HcGKR基因的功能奠定了理论基础.     

基于绿色荧光蛋白瞬时表达的植物亚细胞定位方法

细胞是生命活动的基本单位,各种蛋白质都按照其功能有序地分布在细胞的每个分区中。蛋白质的亚细胞定位是功能基因组学的重要内容。目前植物蛋白质的亚细胞定位方法中应用较普遍的是借助于报告基因表达产物来实现目标蛋白定位的融合报告基因定位法,其中绿色荧光蛋白应用最为广泛。综述了基于绿色荧光蛋白瞬时表达的植物亚细胞定位方法,包括拟南芥原生质体瞬时表达、烟草叶片瞬时表达、洋葱表皮细胞瞬时表达等,同时对上述几种方法进行了比较分析。     

水稻OsWrky基因的细胞核定位研究

绿色荧光蛋白（GFP）基因是一种被广泛应用的报告基因。为了了解克五笔型的水稻WRKY（OsWrky）基因的核定位性质，将OsWRKY与GFP基因融合，并构建在Ubiquitin启动子控制的pCambia130载体上（pCU-oSwrkyGFP)。利用基因枪介导的方法将pCU-OsWrkyGFP导入洋葱内表皮后，荧光显微镜观察GFP的发光部位仅在细胞核内，而作为对照的没有融合OsWRKY基因的载体（pCU-GFP)轰击后细胞质和细胞核中都有荧光。充分说明OsWRKY能作为一个转录因子在细胞核内起作用。     

人乳铁蛋白基因乳腺特异性表达载体的构建及转染研究

构建了携带人乳铁蛋白(LTF)基因、绿色荧光蛋白(GFP)基因的乳腺特异性表达载体(pEBL),用脂质体法转染泌乳期莎能奶山羊乳腺上皮细胞,转染后于荧光显微镜下观察GFP表达情况。用G 418对转染细胞进行筛选,获得抗性细胞克隆,并对转染细胞进行PCR检测。结果显示,pEBL构建成功,转染6 h后可观察到细胞有GFP表达,PCR检测阳性克隆细胞转有LTF基因。表明pEBL载体已转染山羊乳腺上皮细胞,为进一步建立转基因动物乳腺生物反应器奠定了基础。     

AtDME1化学诱导表达载体的构建及其瞬时表达

以拟南芥去甲基化转移酶基因DME1为目的基因,采用酶切、连接和重组反应的方法构建了以17-β-雌二醇为诱导剂的植物表达载体p ER8-DME1。将其转入农杆菌LBA4404菌株中,通过烟草瞬时表达技术,对该载体的诱导表达特性进行了研究。q PCR结果表明,较低浓度的17-β-雌二醇处理能够有效调控p ER8-DME1中目的基因的表达,诱导处理后目的基因表达量逐渐升高,在12 h后达到最高,之后缓慢下降。该载体的成功构建为深入研究DNA去甲基化与植物的生殖发育调控奠定了基础。     

OsWRKY79基因克隆和植物表达载体的构建

WRKY是植物体中重要的转录因子,克隆水稻Os WRKY79基因将为其在植物体内的定位和功能研究奠定基础.根据GenBank公布的Os WRK Y79基因序列设计特异引物,以RT-PCR法从水稻幼苗中克隆OsWRKY79基因,将其亚克隆至含有GFP基冈的pBinGFP表达载体中,经菌落PCR和酶切鉴定,成功构建了重组质粒pBinGFP-Os WRKY79.     

绿色荧光蛋白基因原核表达质粒pET32a-AcGFP1的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

 为了构建绿色荧光蛋白AcGFP1基因的原核表达载体pET32a AcGFP1,并诱导使其在大肠杆菌中高效表达,本研究以pIRES AcGFP1质粒为模板,采用PCR技术特异性扩增绿色荧光蛋白AcGFP1基因,通过酶切和连接使其与原核表达载体pET32a（+）构成重组子,经PCR、酶切和测序鉴定后,重组质粒转化大肠杆菌Rosetta（DE3）,用不同浓度的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达绿色荧光蛋白,经15% SDS PAGE鉴定,结果显示：重组质粒pET32a AcGFP1中的AcGFP1序列与Clontech公司的pIRES AcGFP1质粒的AcGFP1序列完全一致,表明本实验已成功构建了含有绿色荧光蛋白基因AcGFP1的原核表达质粒。此外,pET32a AcGFP1转化Rosetta（DE3）,经不同浓度的IPTG诱导,SDS PAGE检测均获得高效表达,为今后构建pET32a(+) TAT AcGFP1融合表达载体以及深入研究TAT的细胞膜穿透作用的机制奠定基础。     

绿色荧光蛋白基因银耳表达载体构建及表达

以银耳芽孢为材料,由载体pEGFP、pCAMBIA1300经过HindIII和EcoRⅠ双酶切、连接、转化,重组质粒酶切验证,成功构建了由双孢蘑菇gpd启动子调控EGFP基因的银耳真核表达载体,命名pCB-BEGFP。采用电击转化法将携带EGFP基因的银耳表达载体pCB-BEGFP转化到银耳芽孢。提取4个转化子基因组DNA,用EGFP基因特异引物PCR扩增,电泳结果表明有与EGFP基因大小一致的特异带出现;荧光显微镜观察在再生培养基上的转化子可看到很强的绿光;其中一个转化子蛋白SDS-PAGE电泳,结果发现在大约27kD处有一明显的蛋白条带出现,与预期的蛋白分子量相近。以上结果证明EGFP基因转入银耳芽孢中,双孢蘑菇启动子可以调控外源基因的在银耳芽孢中正确表达。     

红麻TIR1基因克隆及其表达载体构建

[目的]分析红麻运输抑制剂响应蛋白1(TIR1)基因在不同组织和不同发育时期花药中的表达情况,并构建其超量表达载体和干扰载体,为研究该基因在雄蕊发育中的调控功能打下基础.[方法]根据红麻花药转录组数据,利用生物信息学方法,克隆TIR1基因cDNA序列,实时荧光定量PCR(qPCR)分析TIR1基因在红麻保持系722B和不育系722A根、茎、叶及不同发育时期花药中的表达情况,并构建超量表达载体和干扰载体.[结果]TIR1基因的开放阅读框(ORF)为1761 bp,编码586个氨基酸(GenBank登录号KY613992).qPCR检测结果显示,与不育系722B相比,不育系722A TIR1基因在四分体期花药中呈显著下调表达(P<0.05,下同),在茎和双核期花药中呈显著上调表达,在单核期花药中极显著上调表达(P<0.01);而在根和叶中,保持系722B和不育系722A中TIR1基因表达水平差异均不显著(P>0.05).超量表达载体pBI121-GFP-TIR1和干扰载体pART27-pK-Tz-Tf构建成功.[结论]红麻TIR1基因编码一个富含亮氨酸重复的F-box蛋白.红麻不育系722A的单核期花药TIR1基因表达较保持系722B极显著上调表达,可能与花药败育有关.构建的超量表达载体和干扰载体,可用于红麻TIR1基因功能及其与雄蕊发育的关系研究.     

NtSKP1-GFP植物表达载体的构建及亚细胞定位

用PCR技术扩增NtSKPl基因的编码区,定向克隆至表达载体pCAMBIA1302上构建用于瞬时表达NtSKPl蛋白的重组质粒.重组质粒经PCR和测序鉴定后用冻融法转入农杆菌LBA4404,进而经农杆菌LBA4404介导转入烟草悬浮细胞,激光共聚焦显微镜观察确定其亚细胞定位.测序结果表明,插入片段与预期序列完全一致,与载体形成了一个完整的基因表达盒;亚细胞定位结果表明NtSKPl蛋白在胞浆和核部位均有分布.     

水稻SLR1基因的克隆及其植物表达载体的构建

[目的]为研究水稻中的SLR1蛋白的功能及寻找与其相互作用的GA信号转导蛋白奠定基础。[方法]以水稻品种日本晴基因组DNA为模板,根据水稻SLR1基因cDNA序列设计1对特异引物进行PCR扩增,回收PCR产物连接到pGEMT载体中,经筛选得到水稻SLR1基因的克隆pGEMTSLR。最后采用酚仿抽提和乙醇沉淀的方法构建水稻SLR1基因的正义和反义表达载体。[结果]通过PCR扩增获得了约为1.9kb的特异片段。回收PCR产物,将克隆片段和pGEMT载体连接后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞,重组克隆经酶切鉴定后提取重组质粒pGEMTSLR1。该研究成功构建了SLR1基因的正义表达载体pCAMSLR(约0.7kb)和反义表达载体pCAMASLR(约1.2kb)。[结论]采用冻溶法可将表达载体pCAMSLR和pCAMASLR导入农杆菌并进行水稻的遗传转化。利用SLR1基因的正义和反义表达载体,可观察转基因植株中该基因的表达上调和下调对植物的影响。     

草莓乙烯受体Ers1基因反义植物表达载体构建

[目的]构建草莓Ers1基因反义植物表达载体,为探明该基因的功能以及采用生物技术方法改良草莓品种奠定基础。[方法]根据已克隆的草莓乙烯受体Ers1基因序列及表达载体pBI121上的酶切位点设计1对带限制性内切酶位点的特异性引物,以Ers1基因的测序质粒为模板,PCR扩增到草莓Ers1基因片段,克隆片段及载体经双酶切消化后,回收产物定向连接,将克隆片段反向补插入到植物表达载体pBI121的35S和gusA之间,构建成该基因的反义植物表达载体。[结果]经酶切鉴定,成功构建了草莓Ers1基因反义植物表达载体。[结论]该研究为进一步探讨Ers1基因功能及利用生物技术方法调控果实成熟衰老进程,从而改善草莓果实的贮运性能奠定基础。     

RT-PCR克隆广谱抗病基因NPR1及其蛋白表达载体构建

[目的]克隆植物广谱抗病基因NPR1并构建其蛋白表达载体。[方法]提取拟南芥总RNA,设计相关引物,采用反转录PCR方法克隆NPR1基因;利用酶切连接方法,将该基因正向导入蛋白表达载体。[结果]经过相关检验,将NPR1正向插入pMXB10载体中,得到了pMXB10-NPR1蛋白表达载体。[结论]成功构建了包含NPR1的蛋白表达载体。     

棉花GhCCR4基因表达载体构建及GUS基因的瞬时表达

研究以GUS基因为报告基因,构建CCR4基因的瞬时表达载体,首先酶切带有CCR4基因的 pGEM-T-CCR4载体,获得CCR4基因目的片段,然后将其克隆到瞬时表达载体pGUS/NIa中,获得由CaMV35S启动子调控目的基因的pGUS-CCR4融合表达载体,使目的基因能够和GUS基因同时表达.采用基因枪法将pGUS-CCR4转化到洋葱表皮细胞中,暗培养24 h,经GUS组织化学染色,检测到多个洋葱细胞呈现蓝色,表明构建的瞬时表达载体可在植物细胞中高效表达.为进一步在棉花中研究GhCCR4基因的功能奠定了实验基础.     

花生CEM1基因的克隆及表达载体构建

通过规模测序和生物信息学分析,从花生荚果不同发育时期全长cDNA文库中筛选出MADSbox家族的一个cDNA全长序列,命名为CEM1基因(GenBank登录号为EY396043)。该基因全长1 061 bp,包含762 bp的开放阅读框,编码253个氨基酸,蛋白质的分子量为29.405 ku,等电点(pI)为9.18。蛋白质信号肽分析和疏水性分析表明,该基因编码的蛋白质信号肽剪切的可能性很小,具有亲水性。同时构建CEM1基因的VIGS表达载体,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

hbFGF基因的克隆及其植物双元表达载体的构建

[目的]为利用植物基因工程技术获取hbFGF基因奠定基础。[方法]采用RT-PCR方法克隆hbFGF基因,将其插入双元表达载体pCambia1301中,构建植物表达载体pCambia1301-hbfgf,并将该表达载体导入发根农杆菌菌株C58C1。[结果]1%琼脂糖凝胶电泳结果显示,hbFGF基因被成功连接到克隆载体pMD18-T上,且重组质粒pMD18-T-hbfgf的DNA测序结果与GenBank中登录的hbFGFcDNA序列完全一致;双元表达载体重组质粒pCambia1301-hbfgf经BamHI消化后进行1%琼脂糖凝胶电泳,结果显示,电泳图谱中出现1200、10000bp2个片段,说明hbFGF基因已被成功克隆到植物表达载体pCambia1301中;农杆菌转化子PCR产物电泳图谱中483bp处出现条带,说明pCambia1301-hbfgf已被转入农杆菌中。[结论]该研究成功获得了可直接用于遗传改良的工程菌pCambia1301-hbfgf-C58C1。     

RT-PCR克隆广谱抗病基因NPR1及其蛋白表达载体构建

[目的]克隆植物广谱抗病基因NPR1并构建其蛋白表达载体。[方法]提取拟南芥总RNA,设计相关引物,采用反转录PCR方法克隆NPR1基因;利用酶切连接方法,将该基因正向导入蛋白表达载体。[结果]经过相关检验,将NPR1正向插入pMXB10载体中,得到了pMXB10-NPR1蛋白表达载体。[结论]成功构建了包含NPR1的蛋白表达载体。     

hHT/GFP融合基因表达载体的构建及在小鼠成纤维细胞中的表达

为探讨超急排斥反应(hyperacute rejection,HAR)及延迟性异种排斥反应(delayed xenograft rejec-tion,DXR)分子调控机制,进行-α1,2岩藻糖苷转移酶基因(hHT)与绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein,GFP)融合表达载体pEGFP-C1-hHT的构建及在小鼠成纤维细胞表达的研究。采用脂质体法转染小鼠成纤维细胞48 h后观察到GFP阳性细胞。同时对GFP阳性小鼠成纤维细胞进行PCR及Western blot,检测hHT基因的整合及表达情况。PCR结果表明hHT基因整合入小鼠基因组,Western blot检测到hHT基因的表达。研究结果表明,成功克隆hHT基因并构建了融合表达载体pEGFP-C1-hHT,可应用于进一步转基因研究。