雌性骆驼生殖组织β-防御素-1基因的克隆及其组织表达量的检测

从雌性骆驼输卵管、子宫、子宫颈、阴道组织中提取总RNA，根据已发表的骆驼β-防御素-1基因的cDNA序列设计合成引物，采用RT—PCR扩增出了骆驼β-防御素-1基因；将扩增产物克隆于pBlueselect T载体后进行了序列分析。以伊肌动蛋白（pactin）基因作为内参，对扩增的β-防御素-1基因进行琼脂糖凝胶电泳后，应用凝胶成像分析系统，推断出了不同组织中β-防御素-1基因的表达量。结果，从雌性骆驼生殖各组织上皮均获得了203bp的β-防御素-1基因的扩增片段，且β-防御素-1基因在雌性骆驼生殖道各组织内的表达量不同。结果表明，β-防御素-1在雌性骆驼生殖组织的先天免疫中起重要作用。     

绵羊β-防御素在毕赤酵母中的表达及活性鉴定

根据GenBank中绵羊β-防御素(SBD-1)的全长cDNA序列设计合成1对引物,PCR扩增SBD-1基因并与T载体成功连接,然后将其成熟肽编码片段亚克隆到毕赤酵母表达载体Ppic9k上,构建真核表达质粒Ppic9k-mSBD-1,将其在毕赤酵母GS115中进行分泌表达,表达产物纯化后进行活性鉴定。结果表明,mSBD-1对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用,而且对金黄色葡萄球菌的抑制作用更为明显。     

β-防御素在金华猪和长白猪肠道中表达规律的研究

本试验旨在研究金华猪和长白猪从初生到60日龄不同肠段中3种β -防御素[β-防御素-1( pBD-1)、β -防御素-2( pBD-2)和β-防御素-3( pBD-3)]基因表达规律,并比较β -防御素基因在2个品种之间的表达差异.选取初生、20、40和60日龄的金华猪和长白猪各3头,屠宰后取十二指肠、空肠、回肠和结肠...     

蒙古绵羊β-防御素基因相对表达水平实时定量PCR方法的建立

为了利用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR技术对蒙古绵羊雌性生殖道β-防御素基因表达水平进行相对定量测定,建立蒙古绵羊β-防御素基因相对表达水平的实时荧光定量PCR方法,试验根据GenBank中羊β-防御素基因序列设计合成引物,进行实时荧光定量PCR,同时以β-Actin为内参基因对β-防御素基因进行均一化处理,利用荧光阈值(Ct值)计算β-防御素基因的相对表达量.结果表明:扩增产物为β-防御素;利用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR技术可以测定蒙古绵羊β-防御素基因表达水平相对含量.     

维生素D3对丝毛乌骨鸡组织中β-防御素基因的表达调控

本试验旨在研究不同水平维生素D3对丝毛乌骨鸡组织中β-防御素(AVBDs)基因表达的调控.采用实时荧光定量PCR方法检测饲喂不同水平(800、1 600、3 200和6 400 IU/kg)维生素D3对丝毛乌骨鸡胸腺、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和法氏囊中3个β-防御素(AVBD-1、AVBD-5和GAL-1)基因表达水平的影响.结果表明:3个β-防御素基因在6个组织中均有表达,其中乌骨鸡AVBD-1和GAL-1基因的最高表达水平都在采食了3 200 IU/kg维生素D3时的空肠;AVBD-5基因的最高表达水平在采食了1 600 IU/kg维生素D3时的十二指肠;在依次采食维生素D3800、1 600、3 200和6 400 IU/kg的乌骨鸡组织中,3个β-防御素基因都存在先升后降的表达趋势.结果表明,β-防御素基因在同一组织的表达水平与维生素D3饲喂水平存在剂量关系,适宜的维生素D3饲喂水平能上调这3个β-防御素基因在乌骨鸡组织中的表达量.     

Dectin-2和TLR-2在酿酒酵母甘露聚糖诱导SBD-1表达过程中的作用

为了探索膜受体Dectin-2和TLR-2在酿酒酵母甘露聚糖诱导绵羊瘤胃上皮细胞(ovine ruminal epithelial cells,ORECs)β-防御素-1(sheepβ-defensin-1,SBD-1)表达过程中的作用。本研究首先利用免疫组化、RT-PCR和Western blot方法确定Dectin-2是否在ORECs内表达;然后采用qPCR和Western blot方法检测甘露聚糖刺激ORECs后Dectin-2和TLR-2的表达变化;最后用qPCR和ELISA方法检测不同质量浓度(0.1,1.0,10.0 mg/L)的Dectin-2和TLR-2特异性封闭抗体对甘露聚糖诱导SBD-1表达的影响。结果显示:ORECs内表达Dectin-2,且甘露聚糖刺激ORECs后Dectin-2和TLR-2的表达量均显著增加(P<0.01);同时甘露聚糖可以诱导SBD-1的表达(P<0.01),但是该表达过程可以被不同质量浓度的Dectin-2封闭抗体和TLR-2封闭抗体所抑制(P<0.05),且随着抗体浓度的增加,这种抑制作用越明显。此外,在封闭抗体质量浓度相同时,Dectin-2封闭抗体比TLR-2封闭抗体抑制SBD-1表达的作用更明显(P<0.05)。结果表明,酿酒酵母甘露聚糖诱导SBD-1的表达与Dectin-2和TLR-2受体有关,但是Dectin-2在此过程中发挥更主要的作用。     

蒙古绵羊雌性生殖道β-防御素(sBD-1)的序列分析及组织表达

从蒙古绵羊输卵管、子宫、子宫颈、阴道组织中提取总RNA,根据GenBank中羊的β-防御素的cDNA序列设计合成引物,通过RT-PCR进行cDNA扩增,获得了301bp的片段。将该片段克隆于pMD-18T载体后进行序列分析,确认该PCR产物为β-防御素。通过相同的RT-PCR反应体系和条件后,对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,以β-actin为参照,根据PCR产物的亮度推断不同组织中β-防御素的表达量。结果,蒙古绵羊雌性生殖道上皮各组织均有β-防御素表达,说明β-防御素在蒙古绵羊雌性生殖道的先天免疫中起重要作用。β-防御素的表达量在雌性生殖道各组织内不同,提示雌性生殖道各组织的防御功能强度不同。     

酿酒酵母细胞壁可通过TLR2受体调控绵羊瘤胃上皮细胞表达SBD-1

旨在研究酿酒酵母细胞壁对体外培养绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1(sheep beta-defensin-1,SBD-1)表达的影响及其调控途径,为揭示酿酒酵母细胞壁对机体免疫的调控机制提供理论依据。本研究将不同质量浓度的酿酒酵母细胞壁提取物(0,25,50,100,200,400mg/L)作用于绵羊瘤胃上皮细胞不同时间(0,2,4,8,12,24h)后,检测上皮细胞SBD-1和Toll样受体-2(TLR2)mRNA表达水平,并进一步通过TLR2阻断试验来证实TLR2是否介导酵母细胞壁促进SBD-1表达。结果表明,不同浓度的酵母细胞壁刺激瘤胃上皮细胞时,随着细胞壁浓度的增加SBD-1mRNA表达量呈先升高后降低的趋势,且酿酒酵母细胞壁质量浓度为200mg/L刺激12h时,SBD-1 mRNA表达量达到峰值,与对照组和其他时间组相比差异显著(P0.05);用质量浓度为200mg/L的酿酒酵母细胞壁刺激绵羊瘤胃上皮细胞不同时间,同样在12h时,TLR2的mRNA表达量达到最大;阻断试验表明TLR2可介导SBD-1的表达。本研究结果表明酿酒酵母细胞壁可促进绵羊瘤胃上皮细胞SBD-1的表达,且质量浓度200mg/L时,刺激瘤胃上皮细胞12h时SBD-1的表达量达到最高,而TLR2参与该调控过程。     

乳酸杆菌诱导绵羊瘤胃上皮细胞内SBD-1的表达

为了解不同乳酸杆菌的刺激对绵羊瘤胃上皮细胞中绵羊β-防御素-1(sheep beta-defensin-1,SBD-1)的可能调节作用,本研究选用了2株具有益生作用的乳酸杆菌,即干酪乳杆菌Zhang(L.casei Zhang)和植物乳杆菌P-8(L.plantarum P-8),首先,运用实时荧光定量PCR技术(RT-q PCR)检测与乳酸杆菌共培养后的绵羊瘤胃上皮细胞中SBD-1mRNA的相对表达量;其次,探讨了2株乳酸杆菌诱导SBD-1 mRNA表达的差异性,选取优势菌株;最后,运用RTq PCR技术和酶联免疫吸附测定(ELISA)的方法,检测优势菌株活菌、灭活菌及其培养上清液对SBD-1基因及蛋白水平表达的影响。结果表明:2株乳酸杆菌均能促进SBD-1 mRNA的相对表达量,乳酸杆菌的浓度为107CFU/m L、刺激细胞8 h时能极显著促进SBD-1 mRNA的相对表达量(P0.01),而L.plantarum P-8强于L.casei Zhang;进一步的研究表明L.plantarum P-8的灭活菌亦可显著诱导SBD-1的基因及蛋白表达(P0.05),但弱于活菌。本研究结果表明L.plantarum P-8和L.casei Zhang均可诱导绵羊瘤胃上皮细胞内SBD-1的差异性表达。     

酿酒酵母β-葡聚糖对绵羊瘤胃外植体SBD-1表达的影响

建立绵羊瘤胃外植体(ovine ruminal explants,OREs)模型,并根据组织学变化和E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达及CK-18和Ki-67的分布评估其活力。培养方案建立后,采用qPCR和ELISA方法检测β-葡聚糖刺激OREs对绵羊β-防御素-1(β-defensin-1,SBD-1)mRNA和蛋白表达水平的影响。HE染色,qPCR和免疫组织化学结果显示培养基内不添加血清培养24 h内的OREs的总体结构较完整,且具有活性。qPCR和ELISA显示,与对照组相比用β-葡聚糖刺激OREs后显著增加SBD-1的mRNA和蛋白表达(P0.05)。本试验确定了OREs体外培养的可行性和最佳条件,并证明β-葡聚糖可以激活瘤胃中抗菌肽SBD-1的分泌。     

牦牛附睾组织不同区段防御素家族基因的表达谱和生物信息学分析

牦牛是高原地区牧民收入的主要经济来源之一，如何提高牦牛的繁殖力一直备受关注。β-防御素是一类具有广谱抗菌活性的肽，研究牦牛β-防御素（Bos mutus β-defensins,bBD）家族在附睾的表达具有重要意义。本实验使用实时荧光定量PCR技术分析牦牛附睾不同区段β-防御素基因的表达情况。结果显示，共有9个β-防御素基因在附睾头、体和尾的表达存在极显著差异。bBD109、bBD119、bBD121、bBD123、bBD128、SPAG11基因集中于附睾头部表达；bBD125与bBD136集中于附睾体部表达；bBD15同时在附睾头部和体部高表达。结合生物信息学分析发现，这9种β-防御素均存在保守的氨基酸序列、反向折叠的β-转角；bBD136脂溶性最高、疏水性强，bBD125和SPAG11相反；β-防御素基因编码蛋白均为不稳定蛋白（bBD123除外），并且预测分析都存在SP型信号肽（除bBD125外）；β-防御素家族基因在附睾不同区段的差异性表达情况以及编码蛋白质的各种理化性质与结构组成等特征都表明其可能在精子成熟过程中发挥着重要作用。     

哺乳动物雌性生殖系统β-防御素的研究进展

β-防御素(beta-defensian,BD)在哺乳动物雌性生殖系统中广泛表达,在免疫、预防生殖道感染及胎儿正常发育等方面起到重要作用。主要对哺乳动物β-防御素在哺乳动物雌性生殖系统组织中的分布、作用及其调控进行了综述,并对其应用前景进行了展望,以期更好地揭示β-防御素在雌性生殖系统中的影响,从而为β-防御素的进一步研究提供理论依据。     

山地乌骨鸡β防御素Gal-2基因的克隆及酵母表达载体的构建

为了构建山地乌骨鸡β防御素Gal-2基因酵母表达载体,试验根据GenBank中鸡β防御素Gal-2基因序列设计引物,采用RT-PCR技术从山地乌骨鸡骨髓细胞中扩增出Gal-2基因,经PCR和酶切鉴定后测序,并采用DNAStar软件进行生物信息学分析;再根据毕赤酵母偏爱密码子和山地乌骨鸡β-防御素Gal-2成熟肽编码基因序列设计并合成1对引物,采用PCR技术从重组质粒pMD18-T-Gal-2扩增出其成熟肽编码基因,并将其插入载体pPICZaA,构建重组质粒pPICZaA-Gal-2,将pPICZaA-Gal-2线性化,通过电击转入毕赤酵母菌株GS115,用1%甲醇诱导表达120 h,表达产物纯化后进行Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定。结果表明:山地乌骨鸡β防御素Gal-2基因克隆成功;山地乌骨鸡β-防御素Gal-2成熟肽编码基因重组真核表达载体构建成功;山地乌骨鸡Gal-2基因在酵母中得到表达。     

玉屏风散对小鼠β防御素-2基因表达的影响

研究玉屏风散益气固表、提高机体对环境病因抵抗力的机理。实验组6只小鼠以玉屏风散水煎液灌胃10 d,对照组6只小鼠给予同体积生理盐水,处死动物后提取肺组织总RNA,通过实时荧光定量PCR测定小鼠在灌服玉屏风散水煎液后β防御素-2基因表达水平。结果实验组小鼠β防御素-2基因的相对表达量是对照组的9.327倍。表明玉屏风散增强机体抵抗力与其可上调β防御素-2基因的表达从而提高机体非特异性免疫力有关。     

山地乌骨鸡β防御素Gal -2基因的克隆及酵母表达载体的构建

为了构建山地乌骨鸡β防御素Gal -2基因酵母表达载体,试验根据GenBank中鸡β防御素Gal -2基因序列设计引物,采用RT - PCR技术从山地乌骨鸡骨髓细胞中扩增出Gal -2基因,经PCR和酶切鉴定后测序,并采用DNAStar软件进行生物信息学分析；再根据毕赤酵母偏爱密码子和山地乌骨鸡β -防御素Gal -2...     

酿酒酵母菌诱导SBD-1 mRNA表达的研究

为了探索益生性酿酒酵母菌对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1(Sheep Beta-Defensin-1,SBD-1)表达的调节作用。建立绵羊瘤胃上皮细胞培养体系作为体外试验模型,用不同浓度酿酒酵母菌对体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞刺激2 h后分别进行不同时间的诱导培养,然后利用实时荧光定量PCR技术(RT-q PCR)研究接受刺激后瘤胃上皮细胞中SBD-1 mRNA表达的差异。结果表明,在各时间组内,SBD-1 mRNA的表达量随着菌液浓度的增加均呈先升高后降低的趋势,当菌液浓度为5.2×107CFU/m L时表达量均达到最大,并与对照组和其他浓度组相比差异极显著(P﹤0.01)。当菌液浓度一定时,SBD-1 mRNA的表达量先是随着诱导培养时间的延长而呈上升趋势,诱导培养时间为12 h时SBD-1 mRNA表达量达到峰值,之后呈下降趋势。因此,当浓度为5.2×107CFU/m L的菌液诱导瘤胃上皮细胞12 h时,SBD-1基因的表达量达到最高,且与此浓度下其他时间组的表达量相比差异极显著(P﹤0.01)。本试验结果表明,酿酒酵母菌能够诱导绵羊瘤胃上皮细胞SBD-1的表达,且浓度为5.2×107CFU/m L的菌液诱导瘤胃上皮细胞12 h时,SBD-1的表达量达到最高。     

猪源β-防御素2和3的研究进展

防御素是一类阳离子抗菌肽,广泛存在于动物和植物体内。猪源β-防御素2和β-防御素3能抵抗猪体内病原微生物,并能调节机体免疫功能,对生殖发育也有一定的生理作用。猪源β-防御素2能促进仔猪生长,对猪红细胞毒性低,能在毕赤酵母中高效表达,其转基因猪也具有较好的抗病性能。因此,猪防御素具有潜在的应用价值。本文就猪源β-防御素2和β-防御素3在体内的表达分布和调控因素、参与调节的信号通路、在生殖发育和畜牧养殖方面的新功能及应用潜力进行综述。     

枯草芽孢杆菌细胞壁对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1表达的影响

为探究枯草芽孢杆菌细胞壁能否对绵羊瘤胃上皮细胞(ovine ruminal epithelial cells,ORECs)中绵羊β-防御素-1(sheep β-defesin-1,SBD-1)的表达产生影响,先利用反复冻融和超声波破碎相结合的方法破碎枯草芽孢杆菌并成功收集其细胞壁,将不同浓度(0、25、50、100、2...     

滩羊β-防御素基因的克隆和表达

选取滩羊β-防御素分布较多的气管、食道和口腔等部位的黏膜组织,提取组织总RNA,RT-PCR获得滩羊β-防御素基因全序列.构建逆转录病毒表达载体,实现滩羊β-防御素基因的表达.经测序后得到滩羊β-防御素编码区的核苷酸序列(64个氨基酸).成功构建了带有滩羊β-防御素基因的逆转录病毒载体pLEGFP-SBD,在蓝光激发光下能观察到绿色荧光蛋白,并用SDS-PAGE方法检测到分子量约为8 kD的目的蛋白.该蛋白具有抗细菌和抑制VSV病毒增殖的活性.     

原位杂交技术检测蒙古绵羊胎儿β-防御素的表达

通过地高辛标记的原位杂交方法来检测β-防御素(sBD-2) mRNA在蒙古绵羊胎儿体内的表达。取4月龄的蒙古绵羊胎儿的肺、胃、肠、子宫、舌、心脏各1 cm3来做原位杂交。结果表明,sBD-2 mRNA在蒙古绵羊胎儿的肺、胃、肠、子宫、舌、心脏为代表的呼吸系统、消化系统、 吸收系统、生殖系统、肌组织中均有分布。因此,sBD-2作为一种广谱高效抗菌肽,广泛分布于胎儿体内。