南林895杨离体培养及耐盐基因GmNHX1的转化

摘要：【目的】建立南林895杨杂交无性系最适遗传转化体系,为创新耐盐南林895杨种质资源奠定基础。【方法】以南林895杨叶片和茎段为外植体,对其再生体系和耐盐基因GmNHX1遗传转化的部分影响因子进行分析。【结果】使用NaClO消毒处理10～15min的外植体褐化率和污染率均较低;以叶片为外植体产生的不定芽状态良好,而茎段分化的不定芽容易白化死亡。PCR检测结果表明,转GmNHX1基因植株可扩增获得符合大小的特异性条带（1641bp）;通过荧光显微镜能够观察到转基因植株中的SGFP激发出的绿色荧光,证明GmNHX1基因已经高效整合到南林895杨的基因组中。【结论】叶片是南林895杨离体培养再生体系的最佳外植体来源,其离体培养所得的植株完全可以满足根癌农杆菌介导基因转化对受体的要求,可用于耐盐基因GmNHX1的遗传转化。     

应用cre/lox植物表达载体的AtNHX1基因转化杨树研究

[目的]研究Na^＋／H^＋逆向转运蛋白AtNHXl基因对杨树的转化。[方法]以杨树南林895杨的叶片作为外植体,采用根癌农杆菌介导法,构建cre／lox植物表达载体,并对3株转基因植株进行PCR分子检测。[结果]结果表明,较适合的转化条件为：外植体在分化培养基上经过2d预培养后于0D600nm值为0．3～0．4的菌液中浸泡7min,卡那抗性绿苗率可达43．9％;PCR分子检测表明,目的基因已经整合到杨树基因组中。[结论]该系统可以应用于杨树的基因工程研究。     

GmVP1基因克隆与转GmVP1/GmNHX1双价基因的大豆发状根耐盐性分析

将Na~+外排和区隔化作用的Na~+/H~+逆向转运蛋白(NHX)的基因和能够为其提供跨液泡膜H~+梯度驱动力的液泡膜H~+-焦磷酸酶(VP)的基因共转化能够提高植物耐盐性。本研究从抗盐大豆品种‘冀豆7号’中克隆得到液泡膜H~+-焦磷酸酶基因GmVP1,构建了GmVP1单价以及GmVP1与GmNHX1双价转化载体,利用发根农杆菌介导的大豆子叶转化体系验证其功能。结果表明,GmVP1在转录水平响应盐胁迫,GmVP1基因在一定条件下可以提高转基因大豆发状根对NaCl的耐受性,GmVP1/GmNHX1双价基因过表达比GmVP1单基因过表达更能提高大豆发状根相对生长量及其耐盐性。     

洞庭湖区11个杨树新无性系的生长差异

为选择出更多适合在洞庭湖区造林的优良杨树无性系,对引进的11个杨树新无性系与南林-95和南林-895在洞庭湖区进行了造林对比试验.对7年生杨树无性系的生长量分析结果表明:11个无性系中,有4-6、7-40、1-20、7-45、2-2无性系胸径、树高、单株材积生长量超过了南林-95和南林-895.其中无性系4-6最具生长...     

甘蓝型油菜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因BnNHX2的电子克隆与序列分析

盐胁迫是造成油菜产量下降的重要环境因子之一。Na^＋／H^＋逆向转运蛋白（Na^＋／H^＋ antiporter,NHX）基因是目前世界植物耐盐性研究领域中最热门的基因,油菜NHX基因的克隆对提高油菜耐盐性的转基因育种意义重大。本研究利用电子克隆的方法,获得1个新的甘蓝型油菜NHX基因BnNHX2的全长cDNA,含有一个长为1629bp的开放阅读框架,编码542个氨基酸,分子质量约59．9ku。生物信息学分析表明,BnNHX2蛋白属于跨膜蛋白,有12个跨膜区,是植物NHX超家族中的一员。通过同源比对和进化分析发现,BnNHX2基因与盐生植物盐芥ThNHXI基因高度同源,表明BnNHX2可能是油菜抵御盐胁迫的关键基因。     

3个杨树无性系蒸腾耗水特性研究

采用Li-6400光合系统测定仪分别于5月、7月、8月、10月对南林895、I-69、皖林1号3个杨树无性系蒸腾特性进行了测定。结果表明,3个供试杨树无性系蒸腾速率日变化和日均值的年变化均趋势大致相同,5月和10月为单峰型,7月和8月为双峰型,各个杨树无性系蒸腾速率均于7月达到一年中的最高值,5月为最低值。各月蒸腾速率日均值分别为I-69(1.87、7.61、2.52和3.34 mmol.m-2.s-1>南林895(1.71、5.57、1.79和2.71 mmol.m-2.s-1>皖林1号(1.13、3.55、1.4和1.96 mmol.m-2.s-1。相关系数及直接通径系数表明,环境因子对蒸腾速率均具有不同程度的影响,除10月的南林895和I-69为Gs>Ta>RH>PAR外,其余均为Ta>RH>Gs>PAR。3个无性系标准木单株日蒸腾量分别是南林895为42 020.84 g,I-69为61 866.03 g,皖林1号为23 346.43 g。     

毛果杨PGR5基因转南林895杨的分子鉴定及表达量

采用农杆菌介导法将毛果杨(Populus trichocarpa)PGR5基因转化南林895杨,经潮霉素抗性基因筛选并对转基因植株进行了分子检测和表达量分析。普通PCR检测结果显示,有12株检测到阳性信号,表明该基因已整合到南林895杨基因组中;经RT-PCR检测,该12株转化子在目的基因处有阳性条带,表明该基因在转录水平表达;实时荧光定量PCR检测结果显示,12株阳性苗的表达量为野生型的2~20倍。     

海马齿Na~+/H~+逆转运蛋白基因SpNHX1的克隆及表达模式

从盐生植物海马齿中克隆了Na+/H+逆转运蛋白基因SpNHX1,生物信息学分析结果表明,Sp NHX1蛋白与拟南芥At NHX1和At NHX2的相似度分别达到了76.35%和77.12%,从而推测,SpNHX1可能具有与At NHX1和At NHX2相似的功能,能将Na+区隔到液泡中,提高植物耐盐性。采用荧光定量PCR的方法,对SpNHX1基因在4种胁迫(600 mmol·L-1Na Cl胁迫、100μmol·L-1ABA胁迫、4℃低温胁迫、20%PEG6000干旱胁迫)下的表达量进行了研究。结果表明:SpNHX1基因在根和茎中受盐胁迫诱导上调表达,叶中表达量变化较小;而在ABA胁迫、4℃低温胁迫、20%PEG6000干旱胁迫下,SpNHX1基因的表达受胁迫影响较小,且没有规律性。说明SpNHX1基因的表达与其耐盐性相关,且表达具有组织特性。     

大豆GmNHX1基因克隆及其在酵母中的耐盐性分析

Na~+/H~+逆向转运蛋白基因在植物响应盐胁迫中具有重要作用。本研究从耐盐大豆品种‘冀豆7号'克隆Na+/H+逆向转运蛋白基因GmNHX1,并利用酵母突变体对该基因的功能进行了初步研究。结果发现,GmNHX1包含1 641 bp的开放阅读框,编码546个氨基酸,有典型的Na~+/H~+逆向转运蛋白特征,与已知功能的液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白具有较高同源性。半定量分析结果表明,GmNHX1受盐胁迫上调表达,在相同浓度盐胁迫下该基因在叶片中的表达量高于根系;耐盐品种‘冀豆7号'在200 mmol/L NaCl胁迫下,其GmNHX1的表达相较0 mmol/L NaCl处理下的表达增加了225%,而盐敏感品种‘冀豆17'只增加了94%。利用nhx1盐敏感酵母突变体进行功能互补试验,结果发现在50,200 mmol/L NaCl胁迫条件下,转GmNHX1酵母突变体菌株生长速度高于对照,GmNHX1具有恢复nhx1酵母突变体耐盐性的功能。     

杨树和柳树富集Cd、Zn、Pb的品种差异性

利用土培试验,以14个杨树和柳树(PopuluS,Salix babylonica)品种为材料,研究了Cd、Zn、Pb复合污染对不同杨树、柳树品种生物量、重金属含量和总吸收量、富集系数(BCF)和转运系数(TF)的影响.结果显示,杨树、柳树在叶、茎、根生物量、株高、重金属含量和总吸收量、BCF和TF上均存在显著的品种差异,随着土壤重金属含量的增加,杨树、柳树重金属含量和总吸收量显著增加,BCF显著降低,TF变化不明显.南林895 (Pop ulus×euramericana(Dode) cv.‘Nanlin-895’)、61-1 (Salixjiangsuensis CL.‘61-1’)和795(Salixjiangsuensis CL ‘795’)重金属含量较高,重金属含量最高的61-1叶片Cd和Zn的含量分别达到29.23、1410 mg· kg-1,但这些品种耐性较低,生物量较小.综合考虑生物量和重金属含量,61-1和南林95(Populus×euramericana(Dode)cv.‘Nanlin-95’)重金属总吸收量较高,富集能力较强,富集能力最强的南林95叶片Cd和Zn的总吸收量分别达到205.62、5 897.94 μg·株‘1.61-1和南林95是有潜力的修复材料.     

高温干旱复合胁迫对杨树幼苗叶经济谱性状的影响

以1年生南林895杨幼苗为材料,采用智能气候室模拟增温环境,设置不同温度和水分梯度,研究高温与干旱复合胁迫对杨树幼苗化学性状、结构性状和光合性能的影响.研究结果表明:(1)高温或干旱单因素胁迫下,南林895杨幼苗光合指标总体呈下降趋势,复合胁迫下净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)、比叶重(LMA)、叶片碳氮比(C/N)下降,胞间CO2浓度(Ci)、叶片全氮(TN)含量上升;(2)光合指标、LMA、C/N和TN含量受温度、水分、温度和水分双因素影响显著(P0.05);(3)单因素胁迫与复合胁迫作用存在差异,杨树幼苗在复合胁迫下受影响更大.     

互花米草NHX1基因的cDNA全长克隆、序列信息及定量表达分析

以盐生植物互花米草(Spartina alterniflora)为试验材料,利用RACE技术克隆到编码Na+/H+逆向转运蛋白的NHX1基因的cDNA全长序列。利用生物信息学软件及网站对获得的基因核苷酸序列及编码的蛋白质序列进行分析,结果发现该核苷酸序列长度为2 277 bp,开放阅读框为1 623 bp,编码540个氨基酸残基,且该基因所编码的蛋白质与植物的Na+/H+逆向转运蛋白NHX1同源,所以命名为SaNHX1基因。同时氨基酸序列比对显示,其与芦苇(Phragmites australis NHX,BAD95562.1)、玉米(Zea mays NHX,XP_008653443.1)、水稻(Oryza sativa NHX,BAA83337.1)等的NHX亲缘关系相近,同源相似性依次为94%、92%、91%。利用Qiagene Rotor Gene Q荧光实时定量PCR仪对不同时间盐处理及ABA处理的互花米草材料进行荧光定量PCR检测。结果发现,在盐处理及ABA处理的不同处理时期,该基因的相对表达量都发生了明显的变化,这表明该基因受到了盐胁迫及ABA胁迫的诱导,由此可以看出Sa NHX1基因与植物的耐盐性有着密切的关系。     

角碱蓬NHX1基因的克隆及在烟草中的表达

Na+/H+逆向转运蛋白在植物抗盐碱的过程中起着至关重要的作用。本实验首次从角碱蓬中克隆出Na+/H+逆向转运蛋白基因NHX1,并将其连接到真核表达载体pBIGFP中,通过农杆菌LBA4404介导转化至烟草中。最后的分子检测实验结果表明,NHX1基因成功整合到了烟草的基因组中并得到了有效表达。     

花花柴耐盐相关基因NHX的克隆与分析

植物NHX属于Na＋/H＋逆向转运蛋白NHE/NHX亚家族的成员,为阳离子逆向转运蛋白家族的一个亚类,具有调节细胞内pH值和Na＋的浓度及维持细胞内离子稳态等多种功能。为进一步开发新疆盐生植物耐盐相关基因资源,本研究以盐生植物花花柴为材料,利用分子克隆技术,从总RNA中克隆编码Na＋/H＋逆向转运蛋白基因。依测序结果判断已从花花柴cD-NA中克隆到1253 bp的NHX基因片段,并对该序列进行数据库搜索和对序列比对分析。结果显示一致性达到68.77%,可以用于构建植物表达载体进行相应的功能鉴定。     

光质对南林895杨生根时间和根长生长的影响

[目的]研究光质对水培植物生根早晚和根生长速率的影响。[方法]以南林895杨为材料,研究了蓝、黑、绿、红和白5种颜色的培养水培盆对南林895杨插穗生根早晚和根生长速率的影响。[结果]在南林895杨插穗水培的早期和中期,蓝盆和黑盆的插穗出芽早且根生长较快,而绿盆、白盆、红盆插穗生根较晚且根生长较慢,在水培后期,光质对插穗根的生长没有显著影响。[结论]蓝光和黑暗条件最适于杨树插穗生根。试验结果为植物水培条件优化研究提供了理论基础。     

表达谱芯片对灰绿藜和水稻NHX1基因在转基因拟南芥中表达差异的研究

[目的]基因芯片作为高通量、高效率的DNA分析技术,已被广泛地用于植物抗逆性功能基因的分析之中.为探讨盐生植物和甜土植物NHX1基因调控盐应答过程和亲水性C端的功能研究提供借鉴,进一步揭示盐生植物和甜土植物耐盐机制的差异,为植物耐盐机理的实际应用提供依据.[方法]利用Affymetrix拟南芥表达谱芯片对过表达盐生植物灰绿藜和甜土植物水稻NHX1基因及缺失部分C端基因的转基因拟南芥进行基因表达差异的分析.[结果]在盐胁迫的转基因拟南芥组织中,筛选出在四组转基因型拟南芥中共同差异表达的基因有394条,占筛选基因总数的1.64;,其中上调表达的基因有177条,下调表达的基因有217条.将这些差异基因初步分为12类, 包括非生物性与生物性刺激的应答过程、胁迫应答过程、电子转移和能量途径、信号转导和转录等功能类别.[结论]表明植物耐盐过程是一个多基因参与的复杂的变化过程, 涉及到许多相关基因的变化.联系两两比较散点图和聚类分析结果从理论上说明,转基因拟南芥cgNHX1,cgNHX1dc,osNHX1和osNHX1dc耐盐性有依次减弱的趋势.     

含抗草甘膦CP4-EPSPS基因和耐逆Trihelix类转录因子GmGT-2A基因的植物表达载体构建及转化验证

高效易用的植物表达载体在基因功能相关研究中起着重要的作用。以植物表达载体p BA002为基础载体,使用抗草甘膦CP4-EPSPS基因替换原载体的Bar筛选标记基因,获得新的植物表达载体p ES002。将大豆耐逆相关Trihelix类转录因子Gm GT-2A连接到p ES002,构建了同时含耐逆相关基因和抗除草剂标记基因的植物表达载体p ES002-Gm GT-2A。利用农杆菌介导的花序浸润法转化拟南芥,并对转基因植株进行抗草甘膦和耐盐性鉴定。结果表明,转基因植株在抗草甘膦和耐盐性上均显著强于对照,表明该载体可以用于转基因相关的基因功能研究。     

菠菜NHX家族基因鉴定及其响应盐胁迫的表达分析

Na~+/H~+逆向转运蛋白(NHX)在植物响应盐胁迫和生长发育过程中发挥着重要的调控作用。本研究对菠菜NHX家族基因进行全基因组鉴定和生物信息学分析,并利用qRT-PCR技术检测NHX基因在盐胁迫下的表达。结果显示,从菠菜基因组中共鉴定出6个SpoNHXs基因,系统进化树分析发现其分属3个亚家族——Vac、Endo和PM;这6个SpoNHXs均具有跨膜结构域,与拟南芥NHX家族成员在不同亚家族中的保守基序高度一致,表明其具有相似的生物学功能;这6个SpoNHXs受盐胁迫上调表达,其中SpoNHX1与SpoNHX6显著上调。本研究结果可为后续SpoNHXs基因克隆和耐盐功能分析提供理论支持。     

柴达木盆地梭梭NHX基因的克隆及其编码蛋白的结构预测

对柴达木盆地梭梭的NHX基因进行扩增,并利用生物软件对NHX基因序列进行分析,对蛋白结构进行预测。结果表明:柴达木盆地梭梭NHX基因长度1 677bp,编码559个氨基酸。NHX蛋白预测显示柴达木盆地梭梭NHX蛋白定位于液泡膜,二级结构主要为α螺旋和无规则卷曲,具有4个N-糖基化位点,1个cAMP、cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点,8个蛋白激酶C磷酸化位点,8个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,9个N-豆寇酰基化位点及1个亮氨酸拉链模型。此外NHX蛋白的亲水性较弱,具有12个跨膜螺旋区。三维结构预测显示NHX蛋白三维结构均主要由α螺旋和无规则卷曲互相盘绕而成,含有少量β折叠,研究结果为下一步柴达木盆地梭梭NHX基因的表达特性及功能研究提供了依据。     

杨树无性系微纤丝角的时空变异模式

应用X射线衍射法对 7个杨树无性系微纤丝角进行了测定。结果表明 ,7个无性系在胸径处的微纤丝角存在一定的差异 ,但差异未达显著水平 (α =0 0 5 )。 7个无性系胸径处微纤丝角平均值大小顺序为I- 72 >I- 6 9≥NL - 80 35 1>南林 - 1388>南林 - 895≥南林 - 4 4 7>南林 - 95 ,其中NL - 80 35 1、I - 6 9杨、I- 72杨与南林 - 95存在较明显差异 ,胸径处的微纤丝角均比南林 - 95杨约高出 30 %以上。杨树微纤丝角的径向变异规律为 :在幼龄阶段 (1～ 3年 )微纤丝角逐渐增大。此后又逐渐减小 ,多项式方程可较好地描述杨树微纤丝角的径向变异规律 (R2 =0 82 6 )。微纤丝角在株内纵向变异规律为同一年轮内微纤丝角变化呈“马鞍型” ,微纤丝角在树木基部最大 ,随着树高的增加逐渐减小 ,当树高到达 13 6m后 ,微纤丝角又开始增大。微纤丝角在株内纵向变异规律也可用多项式方程来描述 (R2=0 6 16 )。本研究结果可为杨树无性系的早期选育和杨树人工林定向培育提供理论依据。