沙田柚遗传转化的探讨

采用含ｎｏｓ基因和人工合成柞蚕抗菌肽Ｄ基因ＡＰ－Ｄ基因的根癌农杆菌对沙田柚外植体进行转基因研究,与根癌农杆菌共培养产生的芽,苗经Ｋｍ敏感性筛选,获得了若干转基因植株,并对这些植株进行了报告基因ｎｏｓ表达的电泳检测,同位素标记、ＡＰ－Ｄ基因为探针的点印迹杂交,外源ＡＰ－Ｄ基因的ＰＣＲ扩增和Ｓｏｕｔｈｅｎ杂交。结果显示,报告基因ｎｏｓ、抗菌肽Ｄ基因已转入沙田柚植株细胞中。     

抗菌肽B基因导入中国樱桃对樱的初步检测

中国樱桃(Prunus pseudocerasus)对樱是北京地区一个半野生樱桃品种,综合性状优良,可作为甜樱桃的砧木和育种材料。樱桃根癌病危害严重,抗菌肽基因可提高樱桃砧木的抗菌能力[1],在建立了对樱不定根离体再生体系的基础上[2],进行了抗菌肽B基因的转化,以期利用基因工程技术获得对根癌病高抗的樱桃砧木抗性种质。本试验对转化植株进行了分子检测。1材料和方法试验所用pPZP质粒DNA为实验保存,携带有北京市农林科学院林果研究所合成的长130 bp的抗菌肽B基因以及Gent基因。采用农杆菌介导叶盘转化法[1]转化。植物材料转基因对樱植株和未转化植…     

根癌农杆菌介导的韭菜基因转化体系的建立

 以GUS 基因为报告基因, 建立了农杆菌介导的韭菜基因转化体系。研究结果表明, 以预培养4～6 d 的根尖为转化受体, 用OD₆₀₀0. 6 ～0. 8 的LBA4404 浸染2～5 min , 共培养2 d , 然后在MS + NAA1 mg/L + BA 2 mg/L + Km 25 mg/L + Timentin 400 mg/L + As 100 mg/L 培养基上培养40 d , 后有愈伤组织产生,转入光下培养20 d 后有少量绿色不定芽产生。经X-Gluc 染色、PCR 分析和Southern blot 检验, GUS 基因已经整合到韭菜基因组染色体上。     

樱桃砧木CAB-6p离体叶片再生体系的优化

以欧洲甜樱桃优良矮化砧木CAB-6p试管苗幼嫩叶片为试材,从基本培养基、激素配比、叶片生理状态和培养基中琼脂用量等方面对影响离体叶片再生的关键因素进行了研究。结果表明,CAB-6p试管苗幼嫩叶片以WPM为基本培养基再生效果最好,明显优于QL和DKW培养基,1/2MS培养基再生效果最差;最佳激素配比是BA2mg/L+IAA2mg/L,用IBA或NAA替代IAA出现愈伤组织生长量大但再生率低;CAB-6p试管苗顶部新发出合拢的幼嫩叶片再生能力最高,半展开的幼嫩叶片和完全展开的幼嫩叶片未能再生植株;用4.5g/L琼脂配制偏软的再生培养基明显有利于提高离体叶片的再生效率。通过以上几个方面的优化,建立CAB-6p试管苗幼嫩叶片高效离体再生技术体系,再生率可稳定地保持在90%左右,平均每叶再生4～5芽。     

樱桃矮化砧木''吉塞拉6号''基因转化体系的建立

采用'吉塞拉6号'甜樱桃矮化砧木(Prunus cerasus×P. canescens)离体叶片外植体,在再生培养基附加生长素的条件下通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(p35SGUS intron)介导研究了β-葡萄糖醛酸酶基因(GUS)的瞬时表达、稳定表达和转基因植株再生,证明了培养基中生长素(IBA或NAA)的存在可促进基因转化,转化效率比对照提高2倍以上.将500个叶片外植体与EHA105(p35SGUS intron)株系在含有生长素的培养基中共培养,获得了11个转基因株系.采用PCR分析和Southern Blotting核酸杂交,确定GUS基因已整合到矮化砧木'吉塞拉6号'植株的染色体上.组织化学染色确定了GUS基因在植株体内的表达.     

樱桃砧木‘本溪山樱’离体叶片再生系统的建立

该试验分别研究了基本培养基种类与激素配比对樱桃砧木离体叶片再生和生根的影响。初步筛选出樱桃砧木‘本溪山樱’诱导培养基,WPM＋6-BA1.5mg/L＋IAA0.1mg/L＋GA0.5mg/L作为转化再生条件,可以诱导较多的再生芽,其再生频率达到76.3%左右。1/2MS＋IBA1.0mg/L可以有效诱导再生芽生根,生根率较高,为93.6%,几乎全部生根,且根系较长,生长健壮。初步探索了抗生素对离体叶片再生系统的影响,卡那霉素30mg/L是‘本溪山樱’遗传转化选择的最佳浓度。     

根癌农杆菌介导蓝猪耳转化系统的建立

 通过对影响根癌农杆菌介导蓝猪耳转化效果各种因素的研究, 建立了蓝猪耳高效稳定的遗传转化系统。研究结果表明, 农杆菌侵染叶片外植体效率最高; 外植体预培养不利于农杆菌的侵染; 乙酰丁香酮能大大提高根癌农杆菌转化蓝猪耳的效率。另外, 菌液浓度、侵染和共培养的时间及再生的途径等均对转化效率有一定的影响。叶片外植体与农杆菌共培养后, 经过抗性芽的诱导、根的再生, 70 d左右就可以获得抗性苗。抗性植株经GUS染色、PCR分析和Southern blot检测, 外源基因已经整合到蓝猪耳基因组中, 转化频率为7%～8%。     

新乔纳金苹果遗传转化及转基因植株再生

新乔纳金苹果遗传转化及转基因植株再生张志宏１景士西１王关林２方宏筠２吴禄平１（１沈阳农业大学果树园艺系，沈阳１１０１６１；２辽宁师范大学生命科学院，大连１１６０２９）关键词苹果；根癌农杆菌；转化；转基因植株ＧｅｎｅｔｉｃＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏ...     

农杆菌介导Ferritin基因转化苹果的研究

以皇家嘎拉苹果的叶片为转化受体,通过根癌农杆菌介导将铁结合蛋白(Ferritin)基因导入受体中,诱导获得了抗性芽.经PCR检测从抗Km植株中选择到4株阳性植株,进一步经PCR-Southern杂交证实外源基因已整合到4株苹果基因组中,RT-PCR检测表明,Ferritin基因在4株转基因植株中得到了表达.     

甜樱桃砧木吉塞拉(Gisela)叶片再生体系研究

 以甜樱桃矮化砧木‘Gisela 5’和‘Gisela 6’的组培苗为试材，研究建立叶片的离体再生体系。结果表明，Gisela 6的再生能力高于Gisela 5；叶片正面接触培养基比背面接触培养基更有利于分化再生。用新梢顶端1~3节新展开的叶片制备外植体，分别接种在WPM+BA 7 mg/L+IBA 0.3 mg/L和WPM+BA 5 mg/L+IBA 0.5 mg/L的培养基上，黑暗处理15 d，Gisela 5的最高分化频率为75.1%，Gisela 6为100%。再生芽苗在三角瓶中生根容易，移人大田后生长正常。     

苹果离体叶片高效再生不定芽技术研究

苹果不同品种叶片再生不定芽能力不同,嘎拉再生能力最强,其次是乔纳金,富士最难再生。用继代培养３ 年以上、当代培养３０ ～５０ ｄ 的试管苗,取顶部第２ ～４ 叶位幼嫩叶片,远轴面向下接触培养基,再生效率高。诱导叶片再生不定芽适宜培养基为ＭＳ＋ ＴＤＺ１．０ ｍｇ·ｌ－ １（ 富士、乔纳金）或ＢＡ５ ．０ ｍｇ·ｌ－ １ ＋ ＮＡＡ０ ．１ ～０．２ ｍｇ·ｌ－ １ ＋ 蔗糖３５ ．０ ｇ·ｌ－ １ ＋ 琼脂６ ．２ ｇ·ｌ－ １（ 嘎拉） 。     

甜樱桃矮化砧木吉塞拉(Gisela)的离体叶片再生植株研究

用甜樱桃矮化砧木吉塞拉（Ｇｉｓｅｌａ）５号、７号（Ｐｒｕｎｕｓ ｃｅｒａｓｕｓ ｘ Ｐ．ｃａｎｅｓｃｅｎｓ）无菌生根苗的叶片作为外植体，进行不定芽再生植株的研究。以ＷＰＭ＋ＢＡ ５～７ ｍｇ／Ｌ＋ＩＢＡ ０．１～１．０ｍｇ／Ｌ做培养基，不定芽再生率高达７０％；吉塞拉５号的再生率明显高于７号；培养基中高浓度的细胞分裂素抑制吉塞拉７号的不定芽再生。不定芽的增殖、生根、温室锻炼、大田移栽均已获得成功，同时观察了植株在大田的生长状况。该成果可用于樱桃转基因育种和多倍体植株培育的研究。     

菊花新品系叶片外植体不定芽再生体系的研究

以'东林4号'、'东林6号'、'东林9号'3个优良菊花品系叶片外植体为试材,探讨了基因型、叶龄、潮霉素浓度等因素对菊花叶片不定芽再生的影响.结果表明:基因型是影响不定芽再生的重要因素,不同品系叶片不定芽再生的激素配比存在明显差异;同一品系,上层幼嫩叶片分化率明显高于中下部.'东林9号'品系叶片不定芽分化率高达90%,'东林9号'叶片及不定芽在30 mg/L的潮霉素中表现为全部死亡.东林4号最适分化培养基为:MS+3 mg/L BA+0.1 mg/L 2,4-D;东林6号最适分化培养基为:MS+2 mg/L BA+1mg/L NAA;东林9号最适分化培养基为:MS+0.5mg/L BA+1.5 mg/L NAA.     

反义AcInv基因导入马铃薯遗传转化体系的优势

以马铃薯品种陇薯3号的茎段和微型薯为受体材料,对其再生和农杆菌介导的遗传转化体系进行了研究。结果表明,茎段愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA2.5mg.L-1+NAA0.5mg.L-1+GA35.0mg.L-1+2,4-D1.0mg.L-1,分化培养基为MS+6-BA3.5mg.L-1+NAA1.0mg.L-1+GA310.0mg.L-1,微型薯薯片再生培养基为MS+ZT2.0mg.L-1+IAA1.0mg.L-1;愈伤组织诱导和生根阶段的选择压分别为Kan50和75mg.L-1,转化时不经过预培养,茎段农杆菌侵染10min,共培养3d;微型薯薄片侵染5min,共培养2d;共培养基中加入50μmol.L-1乙酰丁香酮,茎段抗性愈伤率和分化率分别提高14.29%和6.77%。通过该体系将反义AcInv基因导入马铃薯中,获得了具卡那霉素抗性的转化植株。经PCR检测,外源基因已导入马铃薯基因组中。     

悬铃木叶片植株再生系统的建立

 以悬铃木实生苗叶片及其诱导的愈伤组织为材料建立植株再生系统。结果表明，WPM可作为悬铃木叶片体外再生系统的基本培养基。从基部向上数第5、6、7片叶诱导芽最适培养基为WPM+IBA 0.1(单位mg· L^-1， 下同)+BA 3.0～2.0；对第5片叶在WPM+IBA 0.6+BA 8.0上诱导出的愈伤组织，再进行芽诱导的最适培养基为WPM+IBA 0.1+BA 4.8；幼苗根诱导的最适培养基为1/2 Ms+IBA 0.1～0.5。     

中国樱桃‘对樱桃’不定根离体再生植株的研究

 采用中国樱桃‘对樱桃’( Prunus pseudocerasus) 无菌生根苗的不定根作为外植体, 成功诱导了胚性愈伤组织, 实现了通过分化不定芽和诱导初生体细胞胚两种方式再生植株。根切段在MS + NAA1.0 mg/L + BA 0.05 mg/L + IBA 0.05 mg/L 培养基诱导获得胚性愈伤组织, 诱导频率达54.2 % , 该愈伤组织在MS + NAA 1.0 mg/L + BA 0.5 mg/L 培养基上不定芽分化率为100 % , 不定芽在MS + BA 0.5 mg/L + IBA 0.1mg/L 培养基上生长发育良好, 转入MS + NAA 0.02 mg/L + IBA 0.02 mg/L 生根培养基生根率达100 %; 整体不定根系统在MS 附加2 ,4-D 1.0～3.0 mg/L 和BA 0.5 mg/L 的培养基上同时诱导初生体细胞胚发生和单极不定芽发生, 每外植体上平均体细胞胚数5～25 个, 不定芽3～22 个。体细胞胚转到MS + BA 0.5 mg/L +IBA 0.1 mg/L 培养基上发育为完整植株, 植株再生率100 %。     

云南野生早花象牙参叶片再生体系的建立

 以云南野生的早花象牙参叶片为外植体, 探讨了叶片的不同部位、植物生长调节剂组合、暗培养、水解酪蛋白和椰子汁对愈伤组织诱导和不定芽再生的影响。结果表明: 叶片基部, 暗培养, 水解酪蛋白和椰子汁均有利于愈伤组织的诱导; 暗培养促进了不定芽的再生。适宜早花象牙参叶片愈伤组织形成的诱导培养基为MS + 6-BA 1.5 mg·L ^{- 1} +NAA 0.1 mg·L ^{- 1} +水解酪蛋白800 mg·L ^{- 1} +椰子汁50 mL ·L ^{- 1} , 再生培养基为MS + 6-BA 1.5 mg·L ^{- 1} +NAA 0.1 mg·L ^{- 1} , 增殖培养基为MS + 6-BA 0.6 mg·L ^{- 1} + NAA 0.1 mg·L ^{- 1} , 生根培养基为1/2MS +NAA 0.8 mg·L ^{- 1}。     

磨盘柿离体叶片愈伤组织发生及不定芽诱导

研究了培养基种类、植物生长调节剂配比、叶片不同部位及培养条件对磨盘柿离体叶片愈伤组织发生及不定芽再生的影响。适宜磨盘柿叶片再生的基本培养基为改良MS(1／2 N),生长调节剂为ZT 4.0~6.0 mg/L或TDZ 1.0mg／L与IAA 0.1 mg／L组合,不宜用BA和高浓度的NAA;ZT和TDZ促进叶片再生的方式不同,前者利于直接再生,后者需降低细胞分裂素浓度,二次诱导使芽点生长成苗;叶片接种后暗培养2~3周再生效率高;叶片不同部位中以叶基部最易再生,其次为叶中部,叶尖最差。