传染性喉气管炎病毒gB基因的主要免疫原片段在大肠杆菌中的表达

利用DNASIS等软件分析传染性喉气管炎病毒（ILTV）WG株的gB蛋白抗原性，筛选出一段抗原性较强的片段，该片段位于gB蛋白的403位至686位氨基酸残基之间。设计引物，引入双酶切位点EcoR Ⅰ，Sal Ⅰ，将目的片段t—gB插入原核表达载体pET30a（＋），得到重组表达质粒pET-tgB并转化到大肠杆菌BL21中，经IPTG诱导后，表达分子量为37Ku的融合蛋白His—tgB，表达量占菌体蛋白的40．6％。Western blot分析表明，His—tgB具有免疫反应性。重组蛋白免疫兔之后可以产生针对ILTV gB的特异性抗体。     

水疱性口炎病毒糖蛋白基因主要抗原表位区在大肠埃希氏菌中的高效表达及纯化

利用PCR技术扩增编码水疱性口炎病毒印第安纳型（VSV—Ind）糖蛋白基因的主要抗原表位区，通过引入其两端的EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点，定向插入到pET30c质粒T7启动子下游的多克隆区，构建重组质粒pET30c—vsvG，并转化至宿主菌BL21（DE3）株中。用1mmol／LIPTG诱导后，SDS—PAGE电泳表明，重组蛋白在大肠埃希氏菌中得到了高效表达，经过4h表达即可达到高峰；融合蛋白的相对分子质量为57ku。重组蛋白含有六聚组氨酸尾，主要以包涵体形式存在，Ni柱纯化后的蛋白经Western—blotting鉴定，具有良好的抗原性和特异性。     

DAB389(Gly4Ser)2αMSH重组融合蛋白的构建及表达

利用含有白喉毒素N端序列的基因作上游引物、含有αMSH全序列和（Gly4Ser）2互补序列的基因作下游引物，以pET28a／DAB389（Gly4Set）2EFG为模板，PCR扩增DAB389（Gly4Ser）2αMSH基因片段，用限制性内切酶EcoR Ⅰ和NcoⅠ酶切，并插入原核表达载体pET28a的相应位点，构建了重组表达载体pET28a／DABm（Gly4Ser）2αMSH，在大肠杆菌中表达重组融合蛋白DAB389（Gly4Ser）2αMSH，转化菌经IPTG、30C诱导5h，用SDS—PAGE和Western blot鉴定表达的重组蛋白。结果表明扩增的片段与理论值一致。重组质粒的DNA序列分析正确。SDS—PAGE表明，重组蛋白相对分子质量为45870，且表达量达菌体总蛋白量的29．2％。Western blot分析显示，重组蛋白能特异地与抗白喉抗体结合。成功构建表达了重组DABm（Gly4Ser）2αMSH的工程菌株，表达产物具有生物学活性。     

猪戊型肝炎病毒结构蛋白片段的表达及其在ELISA中的初步应用

为建立一种快速的猪戊型肝炎病毒抗体检测方法，根据已克隆的戊型肝炎病毒株DQ1结构蛋白基因（ORF2）的抗原性及水溶性分析，在其序列上设计一对引物，上游引物和下游引物分别带有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点，用PCR方法扩增，获得369bp大小的相应片段，位于ORF2128—497bp处。将扩增片段克隆到pET-32a构建了原核表达载体pET32a—D001，经测序证明该片段正确插入。将pET32a—D001转化BL21并诱导表达，SDS-PAGE结果显示表达蛋白大小为33ku，Western-blot结果表明表达的蛋白质具有生物活性，将表达蛋白作为诊断抗原，对反应条件进行优化，初步建立了ELISA诊断方法。     

金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白A基因的克隆及其原核表达

根据GenBank中纤连蛋白结合蛋白A基因（fnbA）序列设计了1对特异性引物，以金黄色葡萄球茵基因组DNA为模板，进行PCR扩增；结果获得了3600bp的DNA片段。将PCR产物克隆至pGEM T easy载体中，成功地构建了克隆质粒pGEM—fnbA。以HindⅢ和XhoⅠ双酶切pGEM-fnbA和pET28a（＋），将纯化的基因fnbA亚克隆至pET28a（＋）中，构建了原核表达质粒pET28a-fnbA，并将其转化至E．coli BL21（DE3）感受态细胞中，经1mmol／LIPTG诱导和SDSPAGE分析，在约165ku处出现了与预期目的蛋白一致的外源蛋白带。Western—blotting分析表明，该蛋白具有金黄色葡萄球菌的抗原性。     

鸭肝炎病毒Ⅰ型结构基因vp1的原核表达及其抗原性分析

通过RT-PCR方法克隆出DHV-1：161／79／V结构蛋白vp1基因片段,将其克隆到pMD18-T载体中,测序结果为714bp。vp1经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后,亚克隆到原核表达载体pET-32a（＋）,获得重组质粒pET—VP1,转入E．coli Rosetta-gami（DE3）pLysS,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测结果表明在大肠杆菌中表达了1个相对分子量约为47ku的融合蛋白（Trx-His—VP1）,将此融合蛋白用His-Ni^＋亲和层析法进行纯化。Westernblot分析表明,Trx-His-VP1能与DHV-1阳性血清发生特异性反应,说明表达的结构蛋白VP1具有良好的抗原性。     

坏死梭杆菌白细胞毒素基因的BSBSE片段的原核表达及抗血清制备

本研究以国内分离的牛源坏死梭杆菌F4基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增BSBSE片段,克隆到pMD18-T载体上,鉴定并测序正确后,构建pET32a-BSBSE表达质粒,转化E．coli BL21（DE3）经IPTG诱导、SDS—PAGE检测重组蛋白表达、Western blot检测重组蛋白反应原性。以该重组蛋白免疫兔制备抗血清,经间接ELISA检测抗血清效价。结果表明,PCR扩增得到1100bp的BSBSE片段,以此片段构建了pET32a—BSBSE表达质粒,经诱导后获得了目的蛋白表达,以Western blot检测该重组蛋白证明为本研究的目的蛋白,并且与抗体具有反应原性。以间接ELISA检测该重组蛋白免疫兔制备的抗血清效价达10^5。研究结果将为坏死梭杆菌毒力因子（1kt）的深入研究奠定了物质基础。     

牛分枝杆菌Ag85A基因在大肠埃希氏菌中的表达

以BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切已构建的pGEM-T-85A和pET28a（＋），并将纯化的Ag85A基因亚克隆至pET28a（＋）中，构建出原核表达质粒pET28a-85A。将pET28a-85A转化至感受态E．coli BL21（DE3）中，经IPTG诱导和SDS-PAGE分析，可见约32ku的外源蛋白带。Western-blotting分析表明，该蛋白具有牛分枝杆菌的抗原性。     

土耳其斯坦东毕吸虫原肌球蛋白基因的原核表达

将pGEM—TM质粒上的土耳其斯坦东毕吸虫原肌球蛋白（TM）基因片段亚克隆至原核表达载体pET28a（＋），重组的pET28-TM在大肠埃希氏菌BL21（DE3）中经1mmol／LIPTG诱导表达出-37．5ku的融合蛋白。该蛋白经Ni—NTA亲和层析柱纯化，SDS—PAGE检测，出现与目的蛋白大小一致的单一条带。Western-blotting检测结果表明，纯化的蛋白可被自然感染东毕吸虫的山羊血清识别，这为进一步研究东毕吸虫基因工程疫苗奠定了基础。     

新城疫病毒HN蛋白抗原表位分析及结构域基因原核表达

以本实验室构建的含新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶基因重组质粒为模板，设计引物通过PCR和重叠-延伸PCR扩增，获得HNa、HNb和HNa-L-b三种抗原结构域基因片段，BamHⅠ／HindⅢ双酶切定向克隆到原核表达载体pET32c，获得重组质粒分别命名为pET32c—HNa、pET32c-HNb和pET32c．HNa—L—b。重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21，筛选出阳性克隆，诱导表达并取产物进行分析。结果表明，HNa、HNb、HNa-L-b结构域基因片段均获得了融合表达。Western-blotting分析证实表达产物HNa和HNb与NDV阳性血清具有免疫反应性。本试验结果为进一步研究HN蛋白抗原结构域的免疫原性以及HN蛋白与F蛋白在细胞融合中的相互作用奠定了基础。     

猪IL-18基因的原核表达及重组蛋白的纯化

以pcDNA3．1-pIL-18为模板，采用PCR技术扩增到了猪白细胞介素18（IL-18）的成熟蛋白基因，通过KpnⅠ＋SacⅠ双酶切及连接反应，构建了pET32c—pIL—18原核表达质粒。经过限制性内切酶分析、PCR鉴定及DNA序列测定证实，重组质粒中的基因片段连接正确。之后，重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），于37℃、1．0mmol／L IPTG条件下诱导表达。菌体裂解产物经SDS—PAGE分析，在分子质量约为33ku处出现了预期的目的蛋白。用8mol／L脲对表达产物变性，经Ni^2＋NTA柱纯化，透析复性，得到了纯化的IL-18蛋白。Western—blot分析证实，纯化的重组IL-18蛋白具有反应活性。上述研究结果为重组IL-18的应用奠定了基础。     

牛疱疹病毒Ⅰ型gB基因的原核表达及产物的抗原性分析

采用PCR方法，以牛疱疹病毒Ⅰ型基因组DNA为模板扩增gB基因，克隆至pGEM—T载体。将以克隆质粒pGEM-T-gB为模板扩增的gBⅠ、gBⅡ和gBⅢ基因片段分别连接至原核表达载体pET32a。获得的重组质粒分别转化感受态细胞BL21（DE3），在IPTG诱导下表达。经SDS-PAGE鉴定，gBⅠ、gBⅡ和gBⅢ基因片段在大肠埃希氏菌BL21（DE3）中以融合蛋白形式获得了表达。以磁化组氨酸蛋白纯化系统对融合蛋白纯化后，Western-blotting和ELISA分析结果表明，这些融合蛋白均与BHV-1标准阳性血清反应，可作为抗原用于牛传染性鼻气管炎ELISA检测方法的建立。     

胸膜肺炎放线杆菌毒素ⅠBD基因特异性片段的克隆及表达

以胸膜肺炎放线杆菌（APP）血清1型标准菌株基因组为模板，用PCR扩增ApxⅠ BD基因的特异性片段；对PCR产物纯化回收后与载体pMD18-T进行连接、转化，经酶切和序列分析鉴定后亚克隆到原核表达载体pET28a中，构建重组表达质粒pETIBD；转入大肠埃希氏菌BL21中，以IPTG诱导表达，进行SDS-PAGE电泳。结果，从APP中克隆的ApxⅠ BDDNA序列与已发表序列的同源性为100％，长1447bp，编码482个氨基酸，所表达的融合蛋白相对分子质量约54ku，与预期的大小相符。结果表明，含有ApxⅠBD基因特异性片段的重组表达载体pETⅠBD已成功构建。     

猪传染性胃肠炎病毒特异性受体APN 功能区的初步鉴定

试验为了构建猪氨肽酶N（pAPN）不同基因片段大小的重组质粒并进行原核表达及纯化,经Western—blot、ELISA方法初步鉴定猪氨肽酶N受体功能区。试验构建重组了质粒pET30a—pAPN1（106～669nt）、pET30a—pAPN2（670-1044 nt）、pET30a—pAPN3（1045-1773nt）、pET30a—pAPN4（1774～2328 nt）、pET30a—pAPN5（2329—2889 nt）、pET30a—pAPN6（106—1044nt）、pET30a—pAPN7（1774—2889 nt）;转化宿主菌BL21（DE3）细胞,IPTG诱导表达蛋白,包涵体经SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳回收纯化;用Western—blot、ELISA方法经抗pAPN多克隆抗体初步筛选出pAPN受体功能区。结果表明：pET30a—pAPN2、pET30a—pAPN3、pET30a—pAPN6、pET30a—pAPN7蛋白均以包涵体形式表达并纯化。pET30a—pAPN3、pET30a-6、pET30a-7能与抗pAPN多抗产生特异性反应。经抗pAPN多抗筛选初步鉴定出其主要抗原功能区在36—153aa、349—591aa、592～963aa内。     

牛传染性鼻气管炎病毒糖蛋白gC基因抗原活性区的克隆与表达

通过聚合酶链式反应从牛传染性鼻气管炎病毒Bartha Nu/67株中扩增得到病毒gC基因并克隆至T载体pMD20T,再以后者为模板扩增gC蛋白第15~177位氨基酸对应的抗原活性区片段gCd。将gCd插入原核表达载体pET32a构建重组表达质粒pET32a-bhv1gCd。限制性内切酶以及序列分析鉴定表明重组表达质粒克隆片段序列与阅读框正确。对重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)的培养物进行蛋白电泳,可检测到分子量约45ku的目的产物,IPTG诱导后5h表达量最高。免疫印迹试验结果证实,gCd重组蛋白与牛传染性鼻气管炎标准阳性血清发生特异性反应,表明gC抗原活性区片段在原核获得表达并具有良好的抗原性。该重组蛋白可用于建立ELISA等免疫诊断方法。     

牛乳腺炎无乳链球菌Pgk基因抗原优势区原核表达产物的抗原性分析

为了探索牛乳腺炎无乳链球菌磷酸甘油酸激酶（Phosphoglycerate kinase,Pgk）基因编码蛋白的抗原性,根据GenBank公布的牛源无乳链球菌Pgk基因序列,设计并合成一对引物,通过PCR扩增出Pgk蛋白抗原优势区的编码序列,并对其进行克隆、测序、转化、诱导表达及抗原性鉴定。结果显示克隆的Pgk基因序列含有984 bp,编码328个氨基酸残基。临床分离株与GenBank上公布的B群无乳链球菌菌株Pgk基因（AE009948）核苷酸序列同源性为99.09%,氨基酸序列同源性为99.69%。将扩增的Pgk基因片段克隆至原核表达载体pET30a（＋）中,构建重组表达载体Pgk-pET30a（＋）,再将筛选的阳性重组质粒转化至BL21工程菌,经IPTG诱导获得部分可溶性表达Pgk重组蛋白。经Ni2＋亲和层析柱纯化得到纯度在90%以上的蛋白,经Western blot分析结果表明,重组蛋白具有良好的抗原性,为进一步探索其对奶牛的免疫原性研究奠定了良好的实验基础。     

基因4型HEV上海株ORF_2编码蛋白表达及其抗原性分析

为了表达基因4型戊型肝炎病毒(HEV)上海株ORF2编码蛋白并分析其抗原性,采用套式RT-PCR方法扩增上海猪基因4型HEV代表株结构蛋白基因ORF2部分片段,构建含有该基因片段的pET30a(+)重组表达质粒,命名为pET-E;将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21,经1mmol/L IPTG诱导得到表达,进行SDS-PAGE分析,然后用Western blot鉴定其抗原性,最后纯化蛋白。结果:SDS-PAGE证明该片段得到融合表达,分子量为33 ku。Western blot分析表明,重组蛋白可以与HEV阳性血清反应,表明该蛋白具有良好的抗原性;该融合蛋白含有组氨酸标签,可以用MagExtractor-His-tag-kit进行纯化。用纯化的重组蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA检测89份猪血清样品,阳性率达80.4%,与已有的试剂盒检测结果相比,阳性符合率达95%。     

新疆细毛羊抑制素α亚基cDNA的克隆、序列分析与表达

根据GenBank上登录的绵羊抑制素α亚基基因序列,设计合成2对引物,以新疆细毛羊卵巢提取的总RNA为模板,采用RT—PCR方法扩增获得了约812bp片段,经pMD18-T载体克隆和测序分析证实为新疆细毛羊抑制素α亚基前体基因。进一步通过PCR反应扩增新疆细毛羊INHα亚基基因片段,经过NcoⅠ和HindⅢ双酶切后定向克隆于pET32a原核表达载体,获得pET—INH重组表达载体。将携带有重组表达载体的大肠杆菌BL21（DE3）通过1 mmol·L^-1IPTG进行诱导表达,经过SDS-PAGE电泳检测,显示诱导表达蛋白大约为32ku,与预期表达蛋白大小一致。Western blot检测表明重组原核表达载体在大肠杆菌中成功表达出了目的融合蛋白。新疆细毛羊抑制素α亚基基因的克隆、表达为进一步研究其功能和应用奠定了基础。     

牛分枝杆菌Ag85B基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

以牛分枝杆菌Vallee111染色体DNA为模板．根据已发表的Ag85B成熟蛋白基因的核苷酸序列设计合成特异性引物进行PCR扩增．获得约860bp的DNA片段。通过T-A克隆技术．将PCR产物克隆至pGEM-T载体中．成功地构建出克隆载体pGEM-T-85B。以BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pGEM-T-85B和pET28a（＋）．并将纯化的Ag85B基因亚克隆至pET28a（＋）中，构建出原核表达载体pET28a-85B。将pET28a-85B转化至感受态E.coli BL21（DE3）中．经IPTG诱导和SDS-PAGE分析．可见约30000的外源蛋白带。Western blot分析发现，该蛋白具有牛分枝杆菌抗原性．从而为进一步研究Ag85B的亚单位疫苗及DNA疫苗奠定了基础。     

成熟志贺毒素A亚单位(ShT-A)全长与截短片段在E.coli中的表达及多抗制备

根据GenBank中Ⅰ型痢疾志贺菌ShT-A基因的核苷酸序列，设计合成了2对引物，分别进行PCR扩增，将PCR产物分别与pGEM-T连接构建了克隆质粒pGEM-TA1和pGEM—TA2。用BamHⅠ和KpnⅠ以及BamHⅠ和XhoⅠ双晦切pGEM-TA1和pGEM—TA2．均得到大小为895bp的ShT-A基因片段，分别与pQE30和pET21a（＋）原核重组表达载体连接．构建pQE30-A2和pET-21A，原核重组表达质粒。工程菌M15／pQE30-A2和BL-21／pET-21A1经lPTG诱导．SDS-PAGE电泳观察，均没有目的蛋白表达。这表明全长ShT-A可能对E．coli细胞产生毒性作用。DNAsis软件分析ShT-A基因序列，发现在513bp处有HindⅡ位点．以ShT-A上游引物的BamHⅠ和HindⅡ从pGEM-TA。切出1个513bp的截短片段．重新插入表达载体pQE30．经PCR和双酶切鉴定正确后，得到pQE30-A513重组表达质粒．转化E．coli M15经IPTG诱导．SDS-PAGE电泳观察，在20000处出现1条特异性的表达蛋白带．与截短ShT-A513相对分子质量相符。经薄层扫描分析，试截短片段的表达量约占菌体总蛋白的37．4％，主要为包涵体形式。免疫印迹结果表明．表达的重组ShT—A513，蛋白同抗ShT-A513鼠多抗有特异性结合。