小亚璃眼蜱和亚洲璃眼蜱对环形泰勒虫传播能力的研究

将实验室培养的小亚璃眼蜱（Hyalomma anatolicum anatolicum)和亚洲璃眼蜱（Hyalomma asiaticum asiaticum)清洁幼虫和若虫饲喂于感染环形泰勒虫的牛体，收集饱血幼虫和若虫，用所孵化的若虫和成虫感染试验牛。结果显示，小亚璃眼蜱幼虫、若虫阶级感染，所发育之若虫、成虫均可传播环形泰勒虫；而亚洲璃眼蜱各阶级的传播试验结果均为阴性。     

小亚璃眼蜱、亚洲璃眼蜱和残缘璃眼蜱的分子生物学鉴定

本研究旨在建立小亚璃眼蜱、亚洲璃眼蜱和残缘璃眼蜱的分子生物学鉴定方法,并探讨它们的系统发生关系。在新疆、内蒙古从动物体表采集寄生蜱,形态学鉴定后,PCR扩增测序获得3种璃眼蜱的16S rRNA及线粒体色素氧化酶亚基Ⅰ基因(cytochrome oxidaseⅠ,COⅠ)序列后进行同源性分析。用Mega 5.0和Mrbayes 3.2软件分别构建系统进化树,亚洲璃眼蜱、小亚璃眼蜱样本16S rRNA序列与GenBank中已知相应蜱虫16S rRNA序列聚类,而残缘璃眼蜱COⅠ序列与GenBank中已知残缘璃眼蜱COⅠ序列聚类,与形态学鉴定结果一致。在传统形态学分类的基础上,结合分子生物学鉴定方法能简易、准确鉴定小亚璃眼蜱、亚洲璃眼蜱和残缘璃眼蜱。     

新疆小亚璃眼蜱的鉴定及其携带牛环形泰勒虫病原DNA检测

通过对璃眼蜱形态学及璃眼蜱属特异性基因(ITS-2)和其携带病原基因(Tams1)PCR扩增及其PCR产物的克隆、测序、同源性比较等,鉴定和检测采自新疆吐鲁番地区疑似牛体表璃眼蜱(n=50)及其携带病原状况。结果显示,采集的蜱虫经形态学鉴定均为小亚璃眼蜱,PCR扩增的璃眼蜱种属特异性ITS-2基因和环形泰勒虫Tams1基因序列大小分别为491 bp和534 bp。本试验获得的ITS-2序列与Gen Bank中已记载的小亚璃眼蜱ITS-2序列一致,与形态学鉴定结果相符,故这些璃眼蜱属于小亚璃眼蜱种(Hyalomma anatolicum)。在检测的50只璃眼蜱中,携带牛环形泰勒虫的有3只,阳性率为6%(3/50),并发现所扩增的携带病原目的基因序列与已登录记载的牛环形泰勒虫基因序列相似性为99%。结果表明,在传统形态学分类的基础上,借助分子生物学方法对璃眼蜱种属鉴定及无典型硬蜱种的鉴定具有简易、准确度高等特点,而且在璃眼蜱种属确定的基础上分离其携带的病原更有实际意义。     

小亚璃眼蜱对牛巴贝斯虫未定种和环形泰勒虫传播的试验研究

利用蜱传播试验确定小亚璃眼蜱对中国新分离的牛的巴贝斯虫未定种和环形泰勒虫的传播能力与传播方式，进而明确其在中国牛梨形虫病传播中的流行病学意义。试验结果表明：小亚璃眼蜱可在雌虫阶段受到巴贝斯虫未定种的感染，并可在次代若虫（2／2）和成虫（3／3）阶段将病原传播给试验牛；小亚璃眼蜱幼虫和若虫吸入环形泰勒虫，饱血脱落的幼虫和若虫所蜕化发育的饥饿若虫（2／2）和成虫（2／2）均可将病原传递给敏感动物；感染巴贝斯虫未定种的小亚璃眼蜱饱血雌虫所孵育出的次代幼虫和若虫仍可被环形泰勒虫感染，所发育出的若虫（2／2）和成虫（2／2）可在一次传播试验中将环形泰勒虫和巴贝斯虫未定种同时传播给试验动物。     

小亚璃眼蜱源性牛环形泰勒虫裂殖子表面抗原(Tams1)基因检测及同源性分析

针对牛环形泰勒虫裂殖子表面抗原(Tams1)基因设计特异性引物,对提取的奶牛全血DNA和小亚璃眼蜱组织DNA进行环形泰勒虫病原的PCR扩增,并对PCR产物进行克隆、测序和同源性分析。结果显示,血源性和小亚璃眼蜱蜱源性环形泰勒虫Tams1基因序列大小分别为534bp和546 bp,经NCBI BLAST后发现,血液源性环形泰勒虫与环形泰勒虫印度株同源性为99%,而蜱源性环形泰勒虫与环形泰勒虫意大利株有99%的同源性,表明新疆地区存在环形泰勒虫不同株型的流行。     

麻点璃眼蜱生活史的研究

在实验室条件下，将麻点璃眼蜱（Hyalomma rufipes）幼蜱至若蜱置于牛体或兔体、成蜱置于羊体摄食；若蜱蜕化、饱血雌蜱产卵和孵化在28℃、相对湿度约80％的培养箱中完成。在此条件下，对从甘肃省永靖县羊体获得的麻点璃眼蜱在实验室进行了生活史研究。试验证实，该种蜱为二宿主蜱，一个生活周期需要经过幼蜱、若蜱、成蜱和卵4个发育阶段。幼蜱5－7d饱血，蜕化为若蜱后不离开前一变态期蜱的寄生部位，继续在宿主体上叮咬吸血，经14－24d若蜱饱血脱落。若蜱蜕化期为18－63d，平均40.5d。雌蜱饱血需8－16d，平均12.0d。雌蜱产卵前静止期6－43d，产卵期16－29d，平均22．5d。卵经20－41d孵出幼蜱，平均31．5d。该种蜱在实验室完成一个生活周期需要91－226d。     

亚洲璃眼蜱P27基因的克隆和表达模式分析

为了进一步研究蜱吸血时唾液腺的基因表达调控机制,并为蜱疫苗的制备筛选功能性抗原,本试验对从亚洲璃眼蜱雌蜱吸血前后唾液腺消减文库中筛选出的一个具有Poly（A）尾的EST序列P27进行了研究。首先运用RACE技术扩增出该基因的5′端,在此基础上设计引物,扩增出该基因全长,此基因全长827bp,其开放阅读框从第35个碱基始至第706个碱基止,预测分子量为27．28ku,等电点4．22。生物信息学结构分析表明该基因含有跨膜区及多个活性位点,可能与细胞内DNA的转录相关;该基因与现有其他基因同源性很小,为一新基因;RT-PCR结果显示该基因在半饱血雌蜱的唾液腺、蜱壳、中肠均有表达,但在壳中表达丰度稍低。本研究克隆的P27基因序列已登录GenBank,序列号为EU180067。     

麻点璃眼蜱的鉴定及部分生物学特性研究

1999－2000年3－9月份从甘肃省永靖县的绵羊、山羊体表采集蜱842只（雄虫453只，雌虫389只），经鉴定为麻点璃眼蜱(Hyalomma rufipes).该种蜱对山羊的侵害大于绵羊，，一般寄生于羊后肢内侧，肛门周围和母亲外生殖器周围等无毛或毛稀少、毛毛短的部位。经实验室人工饲养，证明该种蜱为二宿主蜱，饱和血雌虫产卵前的生殖滞育期平均39．5d，产卵期平均22．5d，卵孵化平均27d，幼虫从开始吸血到变为饱血若虫19．5d，饱和血若虫蜕皮约37d；成虫活动季节为3－10月份，5－6月份为高峰期，羊在高峰期的感染率达100％。     

亚洲璃眼蜱唾液腺差异表达基因文库的构建及分析

从单雌蜱克隆群中挑选未吸血雌蜱60只，随机分成两组。未吸血组直接剖取唾液腺．半饱血组于蜱吸血第5d采集，分离唾液腺。Trizol法提取总RNA，经第一链合成、LD—PCR、RasⅠ酶切、接头连接和抑制消减杂交（SSH）等步骤，获得差异表达基因的cDNA片段。将纯化的cDNA片段与pGEMT—Easv我体连接，转化DH5a，获得204个白色菌落。扩增检查表明，136个克隆含有插入片段，片段大小为250bp-850bm，测出有效序列120个。由10个cDNA片段的RT—PCR检查结果初步断定，本研究消减效果良好。由网上资源分析得：21个片段与其他蜱的基因，19个片段与按蚊、库蚊、钩虫、奥斯特线虫等其他吸血寄生虫的基因，9个与果蝇的基因具有同源性。     

亚洲璃眼蜱免疫抑制蛋白p36基因的RNA干扰研究

本研究利用RNA干扰技术研究亚洲璃眼蜱p36基因在其生长、发育、繁殖方面的生物学功能。通过注射p36基因的dsRNA成功实现了该基因的表达沉默,干扰组表达量下降了99%。蜱p36基因沉默后,24 h的吸附率下降了50%,饱血率下降了55.5%,卵孵化率下降了100%。结果表明p36基因在亚洲璃眼蜱吸血和繁殖中具有重要作用。     

亚洲璃眼蜱免疫抑制蛋白P36的分子鉴定及重组表达

为了解蜱吸血和病原传播的分子机制,本研究从亚洲璃眼蜱唾液腺中克隆获得一个编码免疫抑制蛋白P36的同源性基因,该基因全长924bp,编码区为708bp,预测的编码蛋白包含235个氨基酸,分子量为27ku。BLAST分析表明,该基因预测的氨基酸与美洲花蜱和安氏革蜱唾液腺中的免疫抑制蛋白P36高度同源。RT-PCR分析表明,该基因在未吸血成蜱中没有表达,但吸血后表达。将目的基因与载体pGEX-4T-1连接后转化BL21表达菌,经诱导后得到GST融合重组蛋白。该实验结果为进一步研究P36奠定了基础。     

嗜驼璃眼蜱抗菌肽的电泳分析及抗菌活性研究

为探讨嗜驼璃眼蜱血淋巴中抗菌肽的电泳分析方法及其抗菌作用,从半饱血的嗜驼璃眼蜱雌蜱体内抽取血淋巴,用50mL／L的乙酸抽提,经AU—PAGE分析嗜驼璃眼蜱血淋巴中阳离子多肽成分,用电泳凝胶琼脂糖弥散法对各多肽进行抗菌活性的筛选。结果表明,嗜驼璃眼蜱血淋巴中阳离子多肽成分对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌均有很强的抗菌作用。AU—PAGE发现一电泳迁徙率明显高于溶菌酶的阳离子抗菌多肽。提示在嗜驼璃眼蜱的血淋巴中,存在与溶菌酶不同的抗菌多肽,可能是嗜驼璃眼蜱抵御感染的重要分子。AU—PAGE是一种较简单、快速、经济的分离纯化抗菌肽的方法。     

亚洲璃眼蜱唾液腺一新功能基因的克隆与测序

HaB1是亚洲璃眼蜱雌成蜱唾液腺差异表达基因文库中的一个片段,根据其序列设计引物HaB1-GSP1和HaB1-GSP2,以唾液腺总RNA为模板,RACE法扩增获得HaB1的未知3′-末端。测定该末端序列,进行序列拼接,设计全长引物5-′CCAGTCCGAAGGAAGGGCG-3′和5-′TCTC-CGGGCACGTGAAGTGTC-3′。以cDNA第一链为模板,扩增获得基因全长。经核查表明,该基因为一新基因(登录号AY803896)。     

MaxEnt模型对新疆盾糙璃眼蜱生境适应性预测

璃眼蜱属是我国部分区域的优势蜱种,可传播多种病原.为了解新疆地区盾糙璃眼蜱生境适应性,从文献中获取我国新疆地区盾糙璃眼蜱分布点信息,结合环境气候因子数据,运用MaxEnt最大熵模型,分析了19个环境气候因子对盾糙璃眼蜱分布的潜在影响,并分析和预测了当前和未来不同气候模式下盾糙璃眼蜱潜在的地理分布区,筛选出了4个相关的环...     

亚洲璃眼蜱差异表达新基因P18的克隆和鉴定

为了进行抗蜱和蜱传病疫苗的研究,本实验对亚洲璃眼蜱雌蜱吸血前后唾液腺消减文库中获取的一个全长编码基因P18进行了研究。该基因全长519bp,共编码170个氨基酸,分子量为18.36Ku,等电点为4.28。BLAST分析表明,该基因预测的氨基酸与肩突硬蜱、篦子硬蜱唾液腺的抗凝血小肽有30%～40%低度同源性。将该基因亚克隆到pET-32a( )表达载体,转化BL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导,重组融合蛋白以可溶性形式高效表达。将可溶性重组蛋白免疫小鼠后获得的抗血清。经免疫印迹分析表明,该重组蛋白抗体可特异性的识别半饱雌蜱唾液腺中的天然蛋白抗原,而未吸血雌蜱唾液腺中则不显现特异条带。RT-PCR结果进一步证实,该基因在蜱吸血后的唾液腺中差异表达。     

镰形扇头蜱、亚洲璃眼蜱和血红扇头蜱Actin基因的克隆和序列分析

蜱,隶属节肢动物门蛛形纲蜱螨目,寄生于动物体表,以吸食动物血液为生.蜱广泛分布于世界各地,侵袭哺乳动物、爬行动物、鸟类,乃至两栖类等多种动物.蜱和其所携带的病原微生物,如螺旋体、巴贝西虫、贝纳柯克斯体等[1],对动物和人类的健康造成严重危害.肌动蛋白(Actin)是一类进化保守,在多数物种中存在的蛋白质超家族,其基因序列高度同源[2].Actin是细胞组成的基本单位,参与多种生理过程,如细胞运动、胞内运输、细胞质流动、内吞作用等[3].Actin基因及蛋白同时也是多数实验中的首选内参,对完善实验数据、数据分析和实验过程的逻辑性起到重要作用.目前少见对镰形扇头蜱成蜱、亚洲璃眼蜱和血红扇头蜱Actin基因的报道.据此,我们克隆了三种硬蜱的Actin基因,进行了序列分析.     

残缘璃眼蜱玻片标本硼砂卡红染色试验

寄生虫玻片标本制作是做好寄生虫形态观察和分类鉴定的重要手段和方法,科学的染色方法是制作高质量玻片标本的前提和基础.为了建立一种快速、简单、方便且效果良好的制作残缘璃眼蜱玻片标本的方法,本试验用硼砂卡红对残缘璃眼蜱标本进行染色,采用6种浓度的卡红染液与不染色进行染色效果对比,由此选择一种标本清晰度高、对比性强且状态易于识别的染色浓度.结果表明,80％硼砂卡红染液制作残缘璃眼蜱时,玻片标本轮廓结构最清晰,颜色鲜艳明亮,染色后虫体整体为粉红色,假头和躯体界限分明,可作为残缘璃眼蜱玻片标本染色的条件.     

残缘璃眼蜱人工培育及环形泰勒虫的实验性传播

将采自内蒙古自治区的残缘璃眼蜱（Hyalomma detritum)饲喂于牛体，观察了成虫，幼虫，若虫在实验室饲喂条件下的生活周期及滞育现象。通过蜱传播试验证实，残缘璃眼蜱饥饿幼虫，若虫吸入病原，其蜕化之若虫，成虫能将环形泰勒虫（Theileria annulata) 传播给敏感动物，而幼虫阶段吸入病原，如若虫阶段在免体饱血，所蜕化产生的饥饿成虫不传播该病。